以活性污泥為接種污泥厭氧氨氧化工藝的快速啟動(dòng)及脫氮效能

陳加波，周鑫，李旭

（1 中國人民大學(xué)環(huán)境學(xué)院，北京 100872；2 太原理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030600；3 山西省市政工程研究生教育創(chuàng)新中心，山西 晉中 030600）

目前，采用生物方法去除廢水中的氮是解決富營養(yǎng)化問題的經(jīng)濟(jì)有效的途徑。厭氧氨氧化（Anammox）是指利用厭氧氨氧化菌（AnAOB）將NH-N在NO-N存在的缺氧條件下轉(zhuǎn)化為N的一種脫氮工藝。Anammox 因其具有節(jié)省能源和運(yùn)營成本的優(yōu)勢(shì)已廣泛用于高氨氮廢水脫氮研究。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在全球范圍內(nèi)，已經(jīng)有100多個(gè)Anammox裝置成功運(yùn)行，用于處理污泥消化液氨氮濃度高（500～2000mg/L） 和碳氮比（C/N） 低的廢水。然而對(duì)于低濃度廢水，Anammox 的應(yīng)用報(bào)道不多。目前保留并富集AnAOB 是Anammox 快速啟動(dòng)的關(guān)鍵。已有研究證實(shí)，通過使用顆粒污泥、生物絮凝體和生物膜等方式可以促進(jìn)AnAOB富集。

生物膜反應(yīng)器由于污泥濃度高、污泥齡長，經(jīng)常被用作生長緩慢的微生物富集良好反應(yīng)器，包括移動(dòng)床生物膜反應(yīng)器（moving bed biofilm reactor，MBBR）、膜曝氣膜生物反應(yīng)器（membraneaerated biofilm reactor，MABR）和SBBR等。厭氧序批式生物膜反應(yīng)器（anaerobic sequencing batch biofilm reactor，AnSBBR）作為SBBR 的變型工藝，能夠提供Anammox 生存的良好環(huán)境，且具有更高的抗沖擊負(fù)荷能力和更高的生物濃度，進(jìn)而更加適合Anammox 的生長。由于AnAOB 的低生長速率，啟動(dòng)階段尤為困難。為了快速啟動(dòng)Anammox，研究人員嘗試過包括厭氧菌污泥、消化污泥、厭氧污泥和厭氧顆粒污泥等不同類型接種污泥。由于好氧活性污泥是污水處理廠容易獲得的方便廉價(jià)的污泥來源，若能作為AnSBBR 啟動(dòng)Anammox 的接種污泥，將會(huì)大大拓展Anammox 在低濃度污水主流處理的工程應(yīng)用領(lǐng)域。

為此，本研究中通過接種城市污水處理廠普通好氧活性污泥，以聚氨酯泡沫海綿作為填料，建立AnSBBR，并研究其對(duì)Anammox的富集效能與脫氮性能。研究結(jié)果將有助于對(duì)Anammox 快速運(yùn)行啟動(dòng)一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置及運(yùn)行

實(shí)驗(yàn)裝置簡(jiǎn)圖如圖1 所示。AnSBBR 反應(yīng)器由有機(jī)玻璃組成，內(nèi)徑為32cm，高度為30cm，有效容積為5L，填充載體是由聚氨酯制成的立方體海綿（2.5cm×2.5cm×2.5cm）（大連宇都，中國），載體比表面積≥23.3m/g，孔隙率＞95%，堆積密度約為8000n/m。載體的填充率約為50%。AnSBBR 加蓋保持密封，并在反應(yīng)器中通入氮?dú)猓?9.9%純度），以保證嚴(yán)格厭氧環(huán)境。AnSBBR 反應(yīng)器內(nèi)部通過磁力攪拌器進(jìn)行攪拌混合，運(yùn)行溫度保持在30℃。

圖1 AnSBBR反應(yīng)器

1.2 接種污泥與模擬廢水

污泥取自山西省晉中污水處理廠的SBR 反應(yīng)池的活性污泥（MLVSS 為5.5g/L）。將污泥用去離子水洗滌3次后接種到反應(yīng)器中。

采用的人工配水方式，進(jìn)水以NHCl 和NaNO為AnAOB 提供NH-N 和NO-N 源，進(jìn)水基質(zhì)的濃度按理論Anammox 配比，以NaHCO（0.4mg/L）作為無機(jī)碳源，同時(shí)投加一些微量元素，如CaCl·2HO（0.18g/L）、KHPO（0.0272g/L） 和MgSO·7HO（0.3g/L）。

1.3 實(shí)驗(yàn)運(yùn)行

啟動(dòng)階段無添加碳源，以活性污泥為接種污泥，共運(yùn)行168 天，分為5 個(gè)階段，進(jìn)水水質(zhì)及運(yùn)行參數(shù)如表1 所示。表1 中TN表示進(jìn)水總氮，DO表示進(jìn)水溶解氧，HRT表示水力停留時(shí)間。

表1 AnSBBR運(yùn)行啟動(dòng)參數(shù)

1.4 化學(xué)分析

用便攜式pH/Oxi 3420分析儀（WTW 3420，德國）監(jiān)測(cè)DO、氧化還原電位（ORP）、pH 和溫度。 COD、NH-N、NO-N 和NO-N 用HACH Lange快速試劑盒（美國HACH公司）測(cè)定。

1.5 掃描電鏡

在進(jìn)行SEM觀察之前，將生物膜樣品在4 ℃下固定在2.5%戊二醛（pH = 6.8）中約1.5 h。隨后，將樣品用磷酸鹽緩沖溶液（0.1mol/L）洗滌3次，然后在分次水-乙醇溶液（50%、70%、80%、90%和100%）中脫水3次，然后用100%異戊基乙酸鹽洗滌，并在室溫下干燥。最后，將脫水樣品鍍金，并通過掃描電子顯微鏡-能量色散光譜法（SEM-EDS）（日本JSM-7001F）進(jìn)行分析。

1.6 微生物群落分析

在不同時(shí)期（第1 天、第47 天、第90 天和第168天）從反應(yīng)器中取出填料，進(jìn)行破碎，并通過DNA 試劑盒（美國，Omega）對(duì)樣品進(jìn)行DNA 提取。 16SrRNA 的V3-V4 區(qū)引物為341F （5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′） 和 805R （5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）。最后交由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行Illumina 高通量測(cè)序。

2 結(jié)果與討論

2.1 Anammox工藝啟動(dòng)及穩(wěn)定運(yùn)行

AnSBBR 的啟動(dòng)過程如圖2 所示。根據(jù)對(duì)NH-N 的去除效果，啟動(dòng)過程可分為細(xì)胞裂解階段、滯后階段、過渡階段和活性提升階段。階段劃分類似于以前文獻(xiàn)中的階段劃分。

圖2 啟動(dòng)過程總氮去除性能

Anammox 工藝啟動(dòng)初期為細(xì)胞裂解階段（污泥轉(zhuǎn)化階段，第1～11 天）。好氧活性污泥接種在AnSBBR裝置運(yùn)行Anammox工藝后，首先以內(nèi)源反硝化為主。由于環(huán)境條件的變化，接種污泥中的非適應(yīng)細(xì)菌容易發(fā)生細(xì)胞裂解。為了降低出水NH-N濃度，采用提高DO（3～4mg/L）的方式，降低高氨氮對(duì)Anammox的不利影響。隨后進(jìn)入滯后期（第12～21天）。在此階段，出水NH-N 和NO-N 濃度在低氮負(fù)荷率（NLR）時(shí)呈逐漸降低的趨勢(shì)。在這一階段沒有觀察到NH-N 和NO-N 的同步去除現(xiàn)象。在過渡階段（第22～60天），進(jìn)水DO從3.46mg/L降低到0.1mg/L 以下，從第22 天開始，出水NH-N逐漸降低，脫氮率開始提高到60%以上，但反應(yīng)器內(nèi)的生物載體仍然是棕色生物膜，沒有觀察到紅色。第40天開始，NH-N 和NO-N 開始同步下降，同時(shí)，AnSBBR中棕紅色生物載體逐漸開始顯現(xiàn)。當(dāng)?shù)?fù)荷率NLR 為0.017kg/(m·d)時(shí)，氮去除率（NRE）和氨氮去除率（ARE）最高，分別達(dá)到89%和95%以上。據(jù)報(bào)道，活性污泥中首次出現(xiàn)Anammox活性的時(shí)間至少需要60天。

在第61～102 天，Anammox 活性顯著升高，NH-N 和NO-N 的同步去除顯著。而其他研究相比，本研究以好氧活性污泥為接種污泥，采用AnSBBR 反應(yīng)器僅用40 天成功地啟動(dòng)了Anammox。隨后的運(yùn)行，HRT從36 h縮短至24 h，系統(tǒng)仍保持較高的總氮去除率（＞80%），說明系統(tǒng)Anammox反應(yīng)具有較高的穩(wěn)定性。

在階段Ⅴ（第102～168 天），觀察到該階段的總氮去除率和氨氮去除率都達(dá)到了90%以上，系統(tǒng)在縮短HRT 增加進(jìn)水氮負(fù)荷的情況下，Anammox 系統(tǒng)仍表現(xiàn)出優(yōu)異的脫氮性能，說明本系統(tǒng)的Anammox 工藝具有較高的穩(wěn)定性和理想的脫氮能力。

2.2 化學(xué)計(jì)量分析

在實(shí)驗(yàn)過程中，化學(xué)計(jì)量比的變化如圖3 所示?；瘜W(xué)計(jì)量比可以反映反應(yīng)過程中脫氮途徑。根據(jù)Anammox反應(yīng)方程式，理論ΔNO-N/ΔNH-N和ΔNO-N/ΔNH-N 為1.32 和0.26。在階段Ⅰ～Ⅱ，ΔNO-N/ΔNH-N波動(dòng)較大，為3～10，表明此階段幾乎沒有AnAOB，系統(tǒng)DO很高，主要以硝化反應(yīng)為主。階段Ⅲ～Ⅳ，ΔNO-N/ΔNH-N比值接近理論Anammox 反應(yīng)比值1.32，并且保持穩(wěn)定，說明系統(tǒng)存在開始出現(xiàn)了Anammox 效果。而ΔNO-N/Δ NH-N 的比值也在逐漸向0.26 接近，說明Anammox 反應(yīng)逐漸在系統(tǒng)中占據(jù)主導(dǎo)。在階段Ⅴ，當(dāng)反應(yīng)器置于厭氧環(huán)境中運(yùn)行，ΔNO-N/ΔNH-N的比例低于理論值0.26，可能是剛轉(zhuǎn)入?yún)捬醐h(huán)境后系統(tǒng)中存在較為明顯的反硝化作用，因反硝化菌具有比AnAOB 更強(qiáng)的適應(yīng)性。后期因可能存在生物膜內(nèi)源反硝化，故ΔNO-N/ΔNH-N的比值長期低于0.26。

圖3 化學(xué)計(jì)量比變化

2.3 生物膜特性分析

圖4為啟動(dòng)90天生物膜光學(xué)和掃描照片。從圖4(a)和(b)能觀察到生物膜表面的胞外聚合物結(jié)構(gòu)，內(nèi)外附著的黏性結(jié)構(gòu)有所差別，顏色表現(xiàn)為生物載體外層為棕色，內(nèi)層為紅棕色。相較于圖4(a)的生物膜表面，可以發(fā)現(xiàn)，內(nèi)部生物膜的表面結(jié)構(gòu)更為致密，顏色更深更紅，更為貼近AnAOB 的鐵紅色在內(nèi)部的生物膜中富集。填料的多孔結(jié)構(gòu)有利于微生物附著和營養(yǎng)物質(zhì)在內(nèi)部傳質(zhì)。因填料內(nèi)部受氣流與水流的剪切力影響較小，且受濃度波動(dòng)較小，微生物生長環(huán)境較穩(wěn)定，并且在生物膜內(nèi)存在一定的DO濃度梯度因此具有相對(duì)外部更穩(wěn)定的厭氧環(huán)境，厭氧微生物更易生長。因此，填料內(nèi)部的微生物量和群落結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，且出現(xiàn)類似顆粒污泥的團(tuán)狀污泥聚集體。這也說明了采用填充了PU 的AnSBBR 有利于AnAOB 的高效富集和活性發(fā)揮。

圖4 第90 天生物膜光學(xué)照片與掃描電鏡圖

2.4 厭氧氨氧化啟動(dòng)比較

接種污泥的類型對(duì)Anammox 的啟動(dòng)和微生物富集至關(guān)重要。在本研究中，從AnSBBR 中的普通活性污泥中僅用40 天成功啟動(dòng)了Anammox，而其他研究的啟動(dòng)時(shí)間高達(dá)47～90天（表2）。本研究的操作策略包括逐漸降低溶解氧，控制低溶解氧濃度及無溶解氧，結(jié)果這種操作啟動(dòng)方式更有利于Anammox 的快速啟動(dòng)完成，啟動(dòng)時(shí)間大大縮短。在階段Ⅱ（第40～60天），總脫氮效率均超過70%，脫氮負(fù)荷率穩(wěn)定在0.013kg/(m·d)以上，標(biāo)志著Anammox 工藝的成功啟動(dòng)。在60 天之后，系統(tǒng)脫氮率逐漸上升至95%以上，并且保持穩(wěn)定，說明生物膜厭氧氨氧化系統(tǒng)具有較高的穩(wěn)定性和高效的脫氮性能。相較于活性污泥和顆粒污泥，生物膜具有良好的生物持留能力，有利于富集AnAOB 的持留和洗出其他類型的微生物。同時(shí)，生物膜的形成無需長時(shí)間馴化，運(yùn)行操作較簡(jiǎn)單，沒有污泥沉降之慮，適合與大規(guī)模廣泛應(yīng)用。

表2 本研究與其他厭氧氨氧化工藝啟動(dòng)比較

2.5 微生物分析

2.5.1 微生物多樣性分析

微生物群落的多樣性特征如表3所示。物種豐富度用Chaol和ACE表示，物種多樣性用Shannon和Simpson 指數(shù)表示。第1 天、第47 天到第90 天，ACE 和Chaol 的增加表明物種豐富度增加，而Simpson 指數(shù)的降低則表明物種多樣性的增加，表明啟動(dòng)生物膜厭氧氨氧化的過程是一個(gè)生物多樣性趨于復(fù)雜的過程。在階段Ⅴ（第168 天），ACE 和Chaol 指數(shù)的降低表明物種豐度降低，而Shannon的增加和Simpson 指數(shù)的降低則表明物種多樣性的提高。說明在后期，生物膜厭氧氨氧化系統(tǒng)的微生物群落更加多樣化。

表3 微生物群落多樣性指數(shù)

2.5.2 微生物群落構(gòu)成

微生物群落在長期啟動(dòng)多樣性在門和屬水平如圖5 所示。變形菌門、擬桿菌門和酸性細(xì)菌門在所有生物載體中占優(yōu)勢(shì)[圖5(a)]，這與Qin 等的結(jié)果相似。在第47 天和第90 天，變形桿菌門的比例從30.2%上升到79.1%，類桿菌門和酸性細(xì)菌門的比例從30.6% 和13.7%逐漸下降到3.0%和6.9%，說明Anammox 啟動(dòng)過程門水平的優(yōu)勢(shì)微生物群落發(fā)生改變。而對(duì)于包含AnAOB 的門，在階段Ⅴ（第168天）最高達(dá)到了21.6%，相對(duì)地，此階段的Anammox效果最明顯。

不同的啟動(dòng)方式對(duì)AnAOB 的優(yōu)勢(shì)菌屬具有重要影響。Wu 等在CAMBR 中接種硝化反硝化和厭氧顆粒污泥，Wang 等在SBR 和MBR 中接種活性污泥，優(yōu)勢(shì)AnAOB 屬為。Zheng 等在填充了生物膜的SNAD 工藝中以活性污泥啟動(dòng)，發(fā)現(xiàn)成為了優(yōu)勢(shì)菌屬。在本研究，和是檢測(cè)到的AnAOB 優(yōu)勢(shì)菌屬[圖5(b)]。AnAOB 的相對(duì)豐度從第1 天的0.01%增加到第90 天的1.3%，成為優(yōu)勢(shì)功能菌，表明Anammox工藝啟動(dòng)和富集成功。在階段Ⅴ（第168天），AnAOB相對(duì)豐度最高達(dá)到了12%。此外，在第1 天、第47 天和第90 天樣品中，的相對(duì)豐度都高于，這可能是由于系統(tǒng)中的亞硝酸鹽濃度較低時(shí)，以及在生物載體中，a 對(duì)基質(zhì)的親和力更強(qiáng)。在第168天樣品中，成為了優(yōu)勢(shì)AnAOB，推測(cè)原因?yàn)樵诩儏捬醐h(huán)境下具有更強(qiáng)的適應(yīng)性。r是47 天的優(yōu)勢(shì)異養(yǎng)反硝化細(xì)菌屬，相對(duì)豐度為24.1%，但在第90天和第168天時(shí)僅為1.9%和0.1%。門酸桿菌的其他核心屬如和GP4 在長期運(yùn)行過程中略有減少。說明在啟動(dòng)過程中，AnAOB 成為優(yōu)勢(shì)菌群的同時(shí)，各反硝化菌的相對(duì)豐度在減少，但多樣性明顯增加。

圖5 AnSBBR的門和屬的相對(duì)豐度

3 結(jié)論

（1）以活性污泥作為接種污泥，AnSBBR系統(tǒng)經(jīng)過40 天成功啟動(dòng)厭氧氨氧化，60 天運(yùn)行系統(tǒng)脫氮率大于70%。

（2）生物載體生物膜內(nèi)部呈現(xiàn)較紅顏色，SEM顯示內(nèi)部團(tuán)狀的胞外聚合物可能為AnAOB 提供良好的生長微環(huán)境。

（3）在啟動(dòng)過程中，AnAOB 的相對(duì)豐度由最初的0.1%提高到12%，且發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)AnAOB 菌屬由向轉(zhuǎn)變。