基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探討當歸芍藥散延緩皮膚光老化的機制

劉夢涵 田黎明 柯 丹 韓 苗 張鵬程 李 恒 宗世琴 洪 怡張 翀 田代志 陳 龍

（1.江漢大學醫(yī)學院，湖北 武漢，430056；2.武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院皮膚科，湖北 武漢，430022；3.重慶市中醫(yī)院皮膚科，重慶，400000；4.湖北省中醫(yī)院皮膚科，湖北 武漢，430061；5.湖北中醫(yī)藥大學，湖北 武漢，430065）

皮膚光老化是皮膚受到過量的紫外線暴露導致的損傷，在外觀上主要表現(xiàn)為皮膚粗糙、干燥、彈性降低、皺紋加深加粗、色素異常分布以及毛細血管的擴張等，嚴重時甚至引起各種皮膚病變，如日光性角化病、惡性腫瘤等。與皮膚自然衰老相比，光老化在面部等光暴露部位的皮膚衰老中占據(jù)80%以上。因此，如何減緩光老化引起的皮膚損害顯得尤為重要。目前，臨床上可以通過藥物或者防曬等多種手段進行干預。

經(jīng)典名方當歸芍藥散出自《金匱要略》，傳統(tǒng)主治痛經(jīng)、盆腔炎以及慢性腎臟病等疾病。在皮膚科領(lǐng)域，亦可用于痤瘡和黃褐斑等的治療。隨著長期的實踐探索及藥理學研究的深入，其臨床應(yīng)用也在不斷豐富。經(jīng)現(xiàn)代研究證實，當歸芍藥散具有清除自由基、抗氧化損傷、抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫等作用。目前，尚未有已發(fā)表的刊物闡明其提取物中抗氧化有效成分、作用靶點、疾病及通路之間的聯(lián)系。

近年來，鑒于生物信息學、系統(tǒng)生物學和多元藥理學的快速發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學在世界范圍內(nèi)興起。網(wǎng)絡(luò)藥理學是通過網(wǎng)絡(luò)科學的方法，在“疾病-基因-靶點-藥物”的基礎(chǔ)上，從系統(tǒng)和整體的角度闡述生物系統(tǒng)、藥物和疾病之間的復雜性，具有系統(tǒng)性、相關(guān)性和可預測性的特點。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法，探討當歸芍藥散延緩皮膚光老化損傷的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制，并為其開發(fā)利用提供參考。

1 資料與方法

1.1 當歸芍藥散的活性成分篩選

運用 TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http：//www.tcmspw.com/ tcmsp.php），設(shè)定篩選條件為口服生物利用度（OB）≥30%、藥物相似度（DL）≥0.18，分別檢索出“當歸”“白芍”“茯苓”“澤瀉”“川芎”及“白術(shù)”中已報道的有效活性成分及相應(yīng)靶點，并將獲得靶點在UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）中轉(zhuǎn)換出標準化基因名，所有靶點均為人源化，并去除重復基因。

1.2 皮膚光老化相關(guān)靶點的篩選

以“photoaging”作為關(guān)鍵詞，輸入到GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）中，篩選與皮膚光老化相關(guān)的靶點并去除重復靶點。運用Venny2.1.0軟件對當歸芍藥散有效成分靶點與光老化相關(guān)靶點取交集，得到當歸芍藥散作用光老化的預測交集靶點。

1.3 當歸芍藥散活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

在Cytoscape3.9.0軟件中導入當歸芍藥散活性成分及相應(yīng)靶點，繪制當歸芍藥散活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。在該網(wǎng)絡(luò)圖中，根據(jù)每個節(jié)點（node）之間的連接數(shù)目與度值（degree）的大小排序。節(jié)點間聯(lián)系越多，度值越大在網(wǎng)絡(luò)中也越重要，提示可能為當歸芍藥散的核心成分或基因。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將當歸芍藥散與皮膚光老化的24個交集基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org），選擇人源性物種，得到 PPI信息，將獲得的數(shù)據(jù)導入Cytoscape3.9.0軟件，根據(jù)度值和緊密中心度（Closeness Centrality）重新繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 基因本體分析（GO）與通路的富集分析（KEGG）

在David數(shù)據(jù)庫（https：//david-ncifcef.goeL）輸入上述核心作用靶點，獲取顯著富集基因的功能和相關(guān)通路信息。將上述獲得的數(shù)據(jù)在微生信平臺繪圖進行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 當歸芍藥散有效活性成分

根據(jù)篩選要求，在TCMSP平臺中共檢索出當歸芍藥散54種活性化合物，其中當歸2種，白芍13種，茯苓15種，川芎7種，澤瀉10種，白術(shù)7種。在Uniprot數(shù)據(jù)庫進行轉(zhuǎn)換去重后獲得對應(yīng)的基因名107個。見圖1。根據(jù)度值降序排序，居前的有效活性成分為β-谷甾醇（MOL000358）、山奈酚（MOL000422）、豆甾醇（MOL000449）、楊梅酮（MOL002135）、常春藤皂苷元（MOL000296），其中β-谷甾醇為當歸、白芍共有成分，谷甾醇為白芍、川芎、澤瀉共有成分，這些可能為當歸芍藥散延緩皮膚光老化的核心藥效成分。

2.2 當歸芍藥散和皮膚光老化共同作用靶點

在Gene-Cards數(shù)據(jù)庫中收集皮膚光老化靶點，剔除重復數(shù)據(jù)后得到234個。利用Venn分析工具，繪制當歸芍藥散化學成分與皮膚光老化相關(guān)的靶點韋恩圖，共有24個共同靶點。見圖2。通過STRING網(wǎng)站及Cymscape3.9.0軟件，對24個共同靶點進行可視化分析，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)涵蓋24個節(jié)點、157條邊，局部聚類系數(shù)為0.836、平均度值為13.1。在Cymscape3.9.0軟件中，根據(jù)度值和最短路徑篩選出前 10位關(guān)鍵靶點，分別為 TNF、AKT1、IL6、PTGS2、CASP3、JUN、MAPK8、CAT、MAPK14、CASP8。 用 Cymscape3.9.0 對STRING得到的數(shù)據(jù)進行可視化。見圖3。

2.3 GO生物功能分析結(jié)果

將24個共同靶點輸入David網(wǎng)站中，進行GO功能富集分析（P＜0.05），共得到GO條目175條，包括生物學過程（BP）136條、細胞組成（CC）10條、分子功能（MF）29條。根據(jù)P值由低到高進行排序，分別取BP、CC、MF排名前10個條目做可視化分析。見圖4。生物學過程相關(guān)性最大的條目依次為對雌二醇、有機環(huán)化合物的反應(yīng)、參與凋亡過程的半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性的激活、凋亡過程的正調(diào)控、對序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、對基因表達的負調(diào)控、對平滑肌細胞增殖的正調(diào)控、細胞對機械刺激的反應(yīng)以及衰老；與細胞組成密切相關(guān)的條目為細胞質(zhì)、線粒體、細胞核、過氧化物酶體、死亡誘導信號復合物等；分子功能相關(guān)性最大的條目依次為酶結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性以及參與凋亡過程中的半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性、雌激素激活特定DNA結(jié)合序列等。

2.4 KEGG富集通路分析結(jié)果

KEGG分析得到71個條目（P＜0.05），對其排名前20的條目繪制氣泡圖展示（見圖5），主要包括乙型肝炎、癌癥途徑、非酒精性脂肪肝、恰加斯病（美國錐蟲病）、TNF信號通路、弓形蟲病、結(jié)核病、結(jié)直腸癌、Toll樣受體信號通路、凋亡、百日咳、破骨細胞分化、肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）、甲型流感、利什曼病、催乳素信號通路、FOXO信號通路、小細胞肺癌、阿米巴病及軍團菌病。以上數(shù)據(jù)提示，當歸芍藥散延緩皮膚光老化的作用可能與上述信號通密切相關(guān)。

3 討論

UV輻射引起的皮膚光老化作用機制復雜，涉及多種信號分子以及多條信號轉(zhuǎn)導通路。目前，認為主要與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)與免疫抑制、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的作用、細胞凋亡等有關(guān)。隨著對皮膚光老化機制的深入研究，各種抗光老化損傷的手段也應(yīng)運而生。近年來，國內(nèi)外對中藥防治光老化的研究日益增多，越來越多的中藥有效成分抗皮膚光老化的效果得到了認可。

本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學為切入點，通過對有效成分的篩選、靶點預測、網(wǎng)絡(luò)可視化構(gòu)建以及生物信息分析，預測了當歸芍藥散延緩皮膚光老化的潛在作用機制。本研究發(fā)現(xiàn)當歸芍藥散中β-谷甾醇、豆甾醇、山奈酚、楊梅酮等與靶點間聯(lián)系數(shù)目最多，可能是其核心活性成分。

藥理研究表明，它們都具有抗炎、抗氧化和預防腫瘤等多種功能。β-谷甾醇具有清除羥自由基、超氧陰離子的能力。在酒精性肝損傷小鼠模型中，β-谷甾醇可以降低谷胱甘肽的消耗、恢復抗氧化酶活性、減少丙二醛過量產(chǎn)生緩解乙醇引起的氧化應(yīng)激。β-谷甾醇可以增強轉(zhuǎn)錄因子Nrf-2表達，調(diào)節(jié)細胞的氧化還原狀態(tài)，同時抑制腫瘤壞死因子α（TNF-α）等炎癥因子的聚集與釋放，阻斷NF-κB信號的活化，降低MMPs介導的細胞外基質(zhì)降解，進而延緩光老化。豆甾醇、楊梅酮和山奈酚也有類似的抗氧化功能，通過抑制活性氧的產(chǎn)生、抑制MMPs的表達、抗炎等多種作用延緩皮膚衰老。

在基因靶點層面，本研究預測出TNF、IL-6、PTGS2、AKT1、CASP3、JUN、CAT等可能為當歸芍藥散延緩皮膚光老化的核心靶標。促炎介質(zhì)TNF、白介素-6（IL-6）等的抑制可以降低MAPK、NF-κB信號通路誘導的激活蛋白1（AP-1）、MMPs表達，減少膠原降解，也可以下調(diào)環(huán)加氧酶2（PGTS2）、前列腺素等的合成，從而起到抗炎抗氧化的作用。蛋白激酶B同樣在皮膚光老化的過程中發(fā)揮重要作用，在紫外線的照射下，雷帕霉素復合體2（mTORC2）活性增加，使體內(nèi)Akt激活和Akt依賴的IκB激酶α（IKKα）磷酸化，p65發(fā)生易位和磷酸化，進一步引起皮膚的衰老。UV輻射可以通過Fas/FasL途徑誘導細胞凋亡的發(fā)生，TNF-α、Fas/FasL與其受體結(jié)合，激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶Caspase-8，進而激活其下游效應(yīng)蛋白Caspase-3，最終誘發(fā)細胞凋亡。JUN基因表達產(chǎn)物c-Jun蛋白磷酸化后可進入細胞核與c-Fos蛋白結(jié)合形成活化的AP-1，繼而引起MMPs基因轉(zhuǎn)錄。過氧化氫酶（CAT）作為人體重要的抗氧化酶之一，主要參與活性氧的代謝，近期一項研究表明，改變CAT/超氧化物歧化酶（SOD）的組成可能逆轉(zhuǎn)17β-雌二醇介導的細胞衰老。因此，當歸芍藥散可能通過上述靶基因在炎癥反應(yīng)、抗氧化活性、凋亡等方面發(fā)揮延緩皮膚光老化的作用。

GO生物功能分析結(jié)果顯示，當歸芍藥散作用于皮膚光老化的靶點中，BP中涉及到對雌二醇的反應(yīng)。雌二醇可以維持皮膚的厚度和水合作用，增加膠原蛋白和彈性蛋白的含量，減緩基質(zhì)纖維的晚期糖基化最終產(chǎn)物（AGE）交聯(lián)來防止皮膚老化。有研究表明，17β-雌二醇和植物雌激素可以通過調(diào)節(jié)人皮膚細胞的谷胱甘肽含量、ROS及一氧化氮釋放、MMPs表達和線粒體膜電位來延緩皮膚衰老。此外，還涉及細胞凋亡過程的正調(diào)控、對一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、衰老等。以上結(jié)果提示，當歸芍藥散可能通過調(diào)節(jié)多種生物功能進而發(fā)揮延緩皮膚光老化的作用。

在20條KEGG結(jié)果中，TNF信號、Toll樣受體信號以及FOXO信號通路可能為關(guān)鍵通路。TNF信號通路中TNF-α與特異性受體結(jié)合后，可以參與多種生物進程，促進細胞生長、分化、凋亡及誘發(fā)炎癥等。皮膚受到UV輻射后，成纖維細胞及角質(zhì)形成細胞中TNF-a會過度表達，并進一步導致細胞的早衰。目前，有研究表明這一過程可能p38 MAPK和ROS介導的結(jié)果。Toll樣受體（TLRs）可激活多種信號介質(zhì)，如PI3K、AKT、TRAF-6、MAPK等，進而促衰老的人真皮成纖維細胞中AP-1及炎癥因子的表達。叉頭轉(zhuǎn)錄因子FOXO作為公認的長壽基因，參與多種信號調(diào)控，包括能量代謝、細胞周期調(diào)節(jié)、細胞凋亡和維持氧化還原平衡等。FOXO家族成員在皮膚的老化和其他疾病中扮演重要角色，與色素沉著、創(chuàng)面再生、惡性黑色素瘤以及痤瘡等密切相關(guān)，如在皮膚色素沉著中，激活FOXO6和FOXO3a可以上調(diào)抗氧化基因，減輕UVB誘導的氧化應(yīng)激，抑制黑素生成。在傷口愈合過程中，F(xiàn)OXO1的激活與FOXO3的抑制可以促進角質(zhì)形成細胞遷移，進而刺激正常皮膚的傷口愈合。

本研究結(jié)果表明，當歸芍藥散中β-谷甾醇、豆甾醇、山奈酚、楊梅酮等活性成分，可能通過多條信號通路，介導TNF、PTGS2、AKT1、JUN、CASP3和 IL-6等核心靶基因，在氧化應(yīng)激、抗炎、調(diào)控凋亡等方面發(fā)揮延緩皮膚光老化的作用。本研究結(jié)果為進一步實驗、深入驗證當歸芍藥散藥理作用及發(fā)揮其在臨床中的整體療效提供了依據(jù)。