不同來源的順鉑對人Bel7402肝癌細胞體外抑瘤作用的比較

舒 驍 田海梅 張 偉 王 玲 和 龍

順鉑是一種廣譜抗腫瘤藥，其抑制腫瘤的主要作用機制是通過破壞腫瘤細胞的DNA 復制而發揮作用[1-2]，是廣泛應用于實體瘤治療中的重要抗腫瘤藥物，與多種抗腫瘤藥物有協同作用，且無交叉耐藥性。順鉑是周期性特異性藥物，注射后廣泛分布于肝、腎、前列腺、膀胱、卵巢，亦可到達胸、腹腔，極少通過血腦屏障。順鉑的藥動學在人體內符合二室模型，消除半衰期58～73 h，主要通過腎臟排泄。自從1978年順鉑被美國食品和藥物管理局（FDA）批準用于腫瘤化療以來[3]，因其具有療效確切、抗瘤譜廣、抗癌活性高等特點，作為基礎藥物被廣泛應用于臨床。順鉑具有許多其他藥物無法替代的優勢，對睪丸癌的治愈率已超過95%[4]，對肺癌、卵巢癌、頭頸部腫瘤等有肯定的療效[5-10]，尤其是在非小細胞肺癌的藥物治療中作為基礎藥物被廣泛應用[11-12]。

順鉑的劑型包括速溶干粉劑、水針劑、混懸劑、軟膏、栓劑、植入劑、順鉑微囊、順鉑脂質體等[13]，臨床供靜脈使用的順鉑制劑多為凍干粉針劑和水針劑。目前，國內外多家制藥企業生產的順鉑制劑獲得監管機構批準用于腫瘤治療，由于在臨床實踐中發現不同企業生產的順鉑制劑不良反應差異較大，但全球未見不同企業生產的順鉑制劑是否會對療效具有影響的研究，本研究針對不同制藥企業生產的順鉑注射制劑進行了體外細胞毒作用的實驗觀察和比較，可為進一步研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器熒光檢測儀，北京濱松光子技術有限公司，BHP9504。二氧化碳培養箱，美國Thermo 公司，Forma 3111。

1.1.2 試劑盒ATP 生物熒光藥物敏感性檢測試劑盒，北京金紫晶生物醫藥技術有限公司產品。96 孔培養板，Costar 產品。

1.1.3 細胞株人肝癌細胞Bel7402，由中國醫學科學院腫瘤醫院腫瘤研究所生物檢測中心提供。

1.1.4 實驗藥4 種不同來源順鉑制劑見表1。

表1 順鉑制劑來源

1.2 方法

1.2.1 實驗藥的處理1）注射液：直接使用。2）凍干型：用0.9%氯化鈉注射液溶解，終濃度均為1 mg/ml，55 ℃水浴使其完全溶解。

1.2.2 細胞培養將處理好的試驗藥分別稀釋成2.500、1.250、0.625、0.313、0.156 和0.078 μg/ml等6 個濃度，并將此溶液分別加入96 孔培養板中，每孔加入100 μl，每個濃度設定3 個平行孔。取對數生長期細胞，分散成單細胞后計數。向含藥孔中加入各種細胞，每孔接種3 500 個細胞。37 ℃，5%二氧化碳培養72 h。同時設立無藥對照孔和ATP 生產抑制孔。

1.2.3 測定向96 孔培養板中每孔加入ATP 提取液50 μl，室溫下放置5 min。取每孔ATP 提取液50 μl，加入到測定白板中，向每孔加入50 μl 熒光酶/熒光素測定液，混勻后于熒光測定儀上測定吸收值。

1.2.4 統計學分析1）半數抑制濃度：用SPSS 11.5 for Windows PSS 統計軟件中probit 法計算。2）檢驗方法：SPSS 11.5 for Windows 中Kruskal-Wallis H 檢驗法。

2 結果

2.1 半數抑制濃度

4 種藥品對人Bel7402 肝癌細胞的半數抑制濃度結果見表2。

表2 不同藥品對人Bel7402 肝癌細胞的半數抑制濃度(μg/ml)

2.2 數據分析

由表3和表4可知：4 種藥物對該瘤株抑制作用效果的平均秩分別為2.00、6.00、7.00、11.00；K-W統計量為9.462，概率P值為0.024。若取顯著性水平α=0.05，則由于概率P值小于顯著性水平α，應拒絕原假設，認為4 種藥物作用效果存在顯著性差異。

表3 幾種實驗藥對某種疾病的秩和（Kruskal-Wallis） 檢驗結果（1）

表4 幾種實驗藥對某種疾病的秩和（Kruskal-Wallis） 檢驗結果（2）

2.3 兩兩比較

表5用方差分析法得出假設檢驗的結果，由group 一欄的數據可知，數據轉換為秩后的F統計量為16.4，P=0.001。當顯著性水平取0.05 時，則拒絕H0，這與用Kruskal-Wallis H 檢驗的結果一致，即認為不同藥物對該疾病作用效果不同。

表5 經秩變變換后的方差分析結果

表6經SNK 法（兩兩比較）分析得出的結果，由表中的數據可以看出，藥物B 和藥物C 作用效果的差異不大（0.461＞0.05），該4 種藥物的作用效果分屬于不同的層次，其中藥物D（日本化藥）與其他3 種藥物的作用效果不同，效果最好。

表6 不同藥物對某種瘤株作用效果的多重比較

3 討論

在4 種不同來源順鉑注射制劑中，4 種藥物的作用效果分屬于不同的層次，B 和C 的作用效果差異不大，A 種順鉑的體外抑瘤效果最弱，D 種順鉑對人Bel7402 肝癌細胞體外抑瘤作用最強。本實驗結果顯示，不同廠家生產的順鉑在抑瘤作用上有顯著性差異。由于本實驗的結果僅為體外研究，不同來源的順鉑制劑在體內的抑瘤作用和藥效學研究尚需隨機對照臨床試驗來進一步驗證。我國是典型的仿制藥大國，并不是仿制藥強國，藥品的質量和療效與國人的健康密切相關。仿制藥一致性評價工作可使仿制藥在質量和療效方面與原研藥品一致，在臨床中實現替代原研藥品，不僅節約了醫療費用，同時也提高了仿制藥在我國的質量和醫藥行業的整體發展水平，同時可確保公眾用藥的安全性和有效性。我國仿制藥品種數量繁多，但相應一致性評價工作卻很不完善，本研究結果就充分暴露了個別藥品的質量差異，值得引起業界關注。

順鉑的化學結構是簡單的平面四方形，以二價鉑為中心，兩個氨基為配體，同時連接兩個氯作為離去基團。順鉑的活性主要取決于氯離子的濃度[14]，不同價態配位數的鉑衍生物與其抗腫瘤活性及毒性的強弱密切相關[15]。順鉑的臨床作用發揮有賴于有效的劑量濃度和生物學活性。本研究中4 種不同來源的順鉑是來自市售企業生產的合格產品，在臨床上較常見。按照現行《中華人民共和國藥典》（ChP2020）、《歐洲藥典》（EP9.0）、《美國藥典》（USP40）和《日本藥典》（JP17），順鉑注射制劑含量測定均采用高效液相色譜法（HPLC）[16-19]，檢測標準比較一致，說明不同企業生產的順鉑制劑在含量上差異不大，但本研究發現在體外抑瘤作用存在顯著差異，筆者分析，也正因為有這種現象的存在，所以國家必須要對注射劑進行一致性評價。長期以來，注射劑型一直在國內腫瘤化療藥市場占據著主導地位[20]，注射劑的一致性評價是對我國仿制藥的一次重新洗牌，將全面提升我國仿制藥的質量，保證與原研產品質量和療效的一致。注射劑一致性評價的技術要求已逐漸與國際要求接軌，將對我國注射劑的研發和生產提出更高的要求，以充分保障藥品的安全、有效和質量可控。仿制藥的一致性評價工作對中國醫藥行業的發展具有深遠的影響，通過一致性評價的產品必將在未來醫藥市場競爭中發揮積極作用。在國家政策的大力支持下，大型企業紛紛轉型升級。仿制藥是一種巨大的社會公共財富，與原研藥相比價格較低，能夠提升醫療服務水平，降低醫療支出，維護公眾的健康，具有良好的經濟效益和社會效益。我國仿制藥起步雖晚，但是發展迅速，目前已成為世界上最大的仿制藥生產國。由于我國早期批準上市的仿制藥沒有強制要求與原研藥進行一致性評價，有些藥品在療效上與原研藥存在差距，在此背景下，我國提出了仿制藥一致性評價工作要求，隨著注射劑仿制藥一致性評價工作有序推進，國內企業生產的優質仿制藥在滿足我國人民群眾基本醫療保障的同時也會帶動中國逐步從制藥大國走向制藥強國[21]。

本研究在體外實驗中發現不同廠家生產的順鉑在抑瘤作用上有顯著性差異，但在體內試驗中是否也會出現同樣的結果，有待于相關臨床專家開展隨機對照研究來逐步驗證。