熱淋清片微生物限度檢查方法學研究

劉靖華 劉艷平 陳明皓 張秀花

熱淋清片為貴州苗藥頭花蓼單方制劑，具有清熱解毒、利尿通淋功效，用于濕熱蘊結、小便黃赤、淋漓澀痛之癥，尿路感染、腎盂腎炎見上述證候者[1-4]，頭花蓼提取物具有明顯抗菌活性[5-9]，為治療泌尿系統感染的有效藥物。為消除藥物抑菌性，增加污染菌檢出效率，建立了熱清淋片微生物限度檢查稀釋法。該方法操作簡單，重現性好，可供其他實驗室參考使用。

1 儀器與材料

1.1 樣品

市售樣品1，批號：20200501、20200301；市售樣品2，批號：190801。

1.2 培養基

胰酪大豆胨瓊脂培養基，批號：210829；胰酪大豆胨液體瓊脂培養基，批號：210620；沙氏葡萄糖瓊脂培養基，批號：210626；均由北京陸橋技術股份有限公司提供。

1.3 稀釋液

pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，批號：210622，由北京陸橋技術股份有限公司提供。

1.4 菌株

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]，均由中國食品藥品檢定研究院生物制品鑒定所提供。

1.5 儀器設備

電子天平（JE120，上海浦春計量儀器有限公司）、立式壓力蒸氣滅菌器（LDZX-50KBS，上海申安醫療器械廠）、生物安全柜（山東博科生物產業有限公司）、細菌培養箱（KB240，德國BINDER）。

2 方法與結果

2.1 菌液制備

按要求[10-11]將“1.4”項下菌株制成103cfu/ml的菌液備用。

2.2 供試液制備

取“1.1”項下樣品10 g，加稀釋液至100 ml，制成1∶10 供試液備用；取此供試液3 份，每份2 ml，分別加稀釋液2、8、14 ml，制成1∶20、1∶50、1∶80 的供試液備用。

2.3 試驗環境

在D 級背景下的A 級單向流空氣的生物安全柜中進行。

2.4 微生物計數試驗

試驗組：取“2.2”項下供試液，加入“2.1”項下試驗菌液，混勻，使每毫升供試液中含菌量不大于100 cfu；供試品對照組：取“2.2”項下供試液，以稀釋液代替菌液同試驗組操作；菌液對照組：以稀釋液代替供試液，按試驗組操作加入試驗菌。

以上3 組分別取1 ml 注皿，照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1105[10]，需氧菌計數加入胰酪大豆胨瓊脂培養基，霉菌酵母菌計數加入沙氏葡萄糖瓊脂培養基，培養、計數，計算各試驗菌回收率。

2.5 結果判斷

計數方法適用性試驗中，平皿法試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值應在0.5～2 范圍內。

2.6 微生物計數結果

2.6.1 常規法熱淋清片對5 種菌株均具有較強的抑菌作用，除需氧菌計數中黑曲霉外，其他各試驗菌回收比均小于0.5，常規法不能消除樣品中抑菌成分，需要進行進一步試驗。見表1。

表1 常規法試驗結果(n=3)

2.6.2 稀釋法需氧菌計數可采用1∶80 供試液。見表2。霉菌酵母菌計數可采用1∶50 供試液。見表3。

表2 需氧菌計數試驗結果(n=3)

表3 霉菌酵母菌計數試驗結果(n=3)

2.7 控制菌檢查

取胰酪大豆胨液體培養基100、150、200 ml 共3 份，分別加入1∶10 供試液10 ml，以大腸埃希菌為陽性對照，以稀釋液為陰性對照，照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1107[11]，培養、選擇和分離培養、結果判斷。常規法可用于控制菌檢查。見表4。

表4 控制菌檢查結果(n=3)

2.8 微生物限度檢查方法適用性試驗

根據“2.6.1”、“2.6.2”及“2.7”項下確認的方法，對樣品進行微生物限度檢驗方法適用性試驗。3 批樣品5 種菌株回收比均在0.5～2 范圍內，陽性對照組檢出陽性菌，符合藥典要求。見表5。

表5 方法適用性驗證試驗結果

3 討論

微生物污染受人、機、料、法、環等各個環節的影響，不同生產企業，因原料產地、生產工藝等不同，應分別進行微生物限度檢查方法適用性試驗[12]。

為確定樣品的抑菌性大小，本試驗從常規法入手，從表1可以看出，熱清淋片具有極強的抑菌性，為確保污染菌的檢出，必須首先消除樣品的抑菌性。稀釋法為經典的檢驗方法，操作簡單、二次污染概率低，應首選稀釋法進行再試驗。從表2～3 可以看出，5 種菌株在不同培養基中抑菌性不同，需氧菌計數樣品稀釋80 倍，霉菌酵母菌計數樣品稀釋50 倍時，各試驗菌回收比均在0.5～2 范圍內，表明稀釋法可用于微生物計數檢查。

針對不同菌種，樣品的抑菌性不同。從表4可以看出，熱清淋片對控制菌并無抑菌性，常規法可用于控制菌檢查。

在熱淋清片微生物限度方法驗證過程中，根據制劑的抑菌特性，建立了有效的驗證方法，可保證檢驗結果準確，最大程度確保公眾用藥安全有效。