纈沙坦原料藥中7個(gè)亞硝胺類(lèi)基因毒性雜質(zhì)測(cè)定方法的建立及評(píng)價(jià)

陳 丹 汪嘉麗

隨著人類(lèi)老齡化速度的加快，慢性病已成為全球重大公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]，高血壓作為一種慢性非傳染性疾病，是我國(guó)患病率、致殘率較高的慢性疾病[2]。纈沙坦是新一代非雜環(huán)類(lèi)、口服有效的高選擇性血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）1 型受體（AT1）拮抗劑[3]，可以對(duì)AngⅡ介導(dǎo)的生理效應(yīng)產(chǎn)生阻斷作用，抑制相關(guān)的AT1[4]。纈沙坦治療高血壓療效顯著，且血壓穩(wěn)定，耐受性好，是理想的降壓藥物[5]。

2018年7月華海的纈沙坦原料藥中被檢測(cè)出N-亞硝基二甲胺（NDMA），多個(gè)使用華海纈沙坦原料藥制劑廠(chǎng)家生產(chǎn)的沙坦類(lèi)藥物被召回。歐盟發(fā)布了1 個(gè)超級(jí)化合物結(jié)構(gòu)，包含了目前所有的基因毒性雜質(zhì)和潛在基因毒性雜質(zhì)，例如磺酸酯類(lèi)、鹵代烷烴類(lèi)和N-亞硝胺類(lèi)等，基因毒性雜質(zhì)能夠直接或間接損傷細(xì)胞 DNA，產(chǎn)生致突變和致癌變作用[6]。因此需要建立纈沙坦原料藥中7 個(gè)亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)的測(cè)定方法，本方法建立了LC-MS/MS 法測(cè)定纈沙坦原料藥中7 個(gè)亞硝胺基因毒性雜質(zhì)，可以為纈沙坦的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

電子天平：METTLER TOLEDO XPE205、METTLER TOLEDO XP205；Agilent 1290 Infinity II-6470QQQ 液質(zhì)聯(lián)用儀（Agilent 公司），大氣壓化學(xué)離子源（APCI），MassHunter 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；旋渦混合器：XW-80A，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠(chǎng)。

1.2 試劑

NDMA 對(duì)照品（N-亞硝基二甲胺）：BePure，C00005827，100 μg/ml；NMBA 對(duì)照品（N-亞硝基-4-甲基-4-氨基丁酸）：BePure，17753-024，100 μg/ml；NDEA 對(duì)照品（N-亞硝基二乙胺）：Dr.Ehrenstorfer，1004267ME，100 μg/ml；NEIPA 對(duì)照品（N-亞硝基乙基異丙胺）：BePure，C0007125，97.9 μg/ml；NDIPA對(duì)照品（N-亞硝基二異丙胺）：BePure，18091-001，100 μg/ml；NDPA 對(duì)照品（N-亞硝基二丙胺）：BePure，19686-030，100 μg/ml；NDBA 對(duì)照品（N-亞硝基二丁胺）：Dr.Ehrenstorfer，1022644ME，10 μg/ml；實(shí)驗(yàn)用水：屈臣氏蒸餾水，批號(hào)：20200520；甲酸：色譜級(jí)，東京化成工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)：DY46N；甲醇：質(zhì)譜級(jí)，霍尼韋爾，DW921-CN。6 批纈沙坦原料藥皆由同一廠(chǎng)家提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密量取NDMA、NMBA、NDEA、NEIPA、NDIPA、NDPA、NDBA 對(duì)照品溶液各0.5 ml，分別置50 ml 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻即得1 μg/ml 對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取NDBA 對(duì)照品溶液2 ml 置20 ml 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻即得1 μg/ml 對(duì)照品儲(chǔ)備液。再用甲醇定量稀釋制成每毫升含1 ng、2 ng、5 ng、10 ng、20 ng、50 ng、100 ng 的混合對(duì)照品溶液。

2.2 色譜及質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件色譜柱：Agilent poroshell PFP（100 mm×2.1 mm，2.7 μm），泵混合器與進(jìn)樣器之間接Agilent poroshell 120EC-C18（4.6×50 mm，2.7 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.4 ml/min；自動(dòng)進(jìn)樣溫度：4 ℃；進(jìn)樣量：2 μl；NDMA、NMBA、NDEA、NEIPA、NDIPA、NDPA、NDBA 的保留時(shí)間分別為1.09、1.88、3.35、4.52、5.48、5.74、8.02 min。8.2 min 之后切出質(zhì)譜。

流動(dòng)相A：0.1%甲酸的水溶液；流動(dòng)相B：甲醇；洗脫梯度：0.0～1.5 min，10%B；1.5～3.0 min，30%B；3.0～5.0 min，50%B；5.0～7.0 min，55%B；7.0～9.0 min，95%B；9.0～10.0 min，95%B；10.0～10.1 min，10%B；10.1～15.0 min，10%B。

離子源：APCI+；檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；干燥器溫度250 ℃，鞘氣溫度350 ℃，電離電壓1 500 V，電暈針電流6 μA，霧化氣壓力35 psi，干燥氣流速4 L/min。質(zhì)譜采集時(shí)間為0～8.2 min。

2.2.2 質(zhì)譜條件7 個(gè)組分質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 7 個(gè)組分質(zhì)譜參數(shù)

2.3 專(zhuān)屬性

取空白溶劑和混合雜質(zhì)對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣，采集色譜圖，7 個(gè)組分均能有效分離。見(jiàn)圖1～2。

圖1 空白溶劑LC-MS/MS 分析

圖2 7 個(gè)組分的LC-MS/MS 分析

2.4 范圍及線(xiàn)性

按照2.1 線(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法進(jìn)行溶液配制并且進(jìn)行LC-MS/MS 分析，記錄色譜圖，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以濃度（ng/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到線(xiàn)性方程如下。NDMA：Y=37.38X+10.74，r=0.999 8；NMBA：Y= 61.48X-4.15，r=0.999 8；NDEA：Y=69.19X-2.45，r=0.999 8；NEIPA：Y=251.37X+27.69，r=0.999 8；NDIPA：Y=106.02X-5.55，r=0.999 9；NDPA：Y= 221.08X-8.06，r=0.999 4；NDBA：Y=193.56X+119.08，r=0.999 5。

結(jié)果表明，NDMA、NMBA、NDEA、NEIPA、NDIPA、NDPA、NDBA 在1～100 ng/ml 范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.5 檢測(cè)限與定量限

取2.1 項(xiàng)下雜質(zhì)對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋直至各雜質(zhì)的信噪比約為10 時(shí)的濃度作為定量限，信噪比約為3 時(shí)的濃度作為檢出限。見(jiàn)表2。

表2 7 個(gè)亞硝胺雜質(zhì)檢出限、定量限

2.6 精密度（重復(fù)性）

取標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)1 溶液2 μl 連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算NDMA、NMBA、NDEA、NEIPA、NDIPA、NDPA、NDBA 雜質(zhì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為3.02%、5.12%、5.13%、6.26%、7.71%、4.46%、3.24%，RSD 均小于8%。

2.7 樣品溶液中的亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)測(cè)定

2.7.1 樣品溶液的配制精密稱(chēng)取纈沙坦0.2 g，4 批稱(chēng)樣量分別為0.222 0 g、0.203 5 g、0.212 8 g、0.216 5 g，至離心管中，精密加入甲醇10 ml，渦旋混勻1 min，溶解后經(jīng)0.22 μm 濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液測(cè)定即可。

2.7.2 測(cè)定結(jié)果依次取上述溶液各2 μl 進(jìn)樣，6 批纈沙坦原料藥中7 個(gè)基因毒性雜質(zhì)均未檢出。

2.8 準(zhǔn)確度（加樣回收率）

2.8.1 纈沙坦原料藥溶液的配制低濃度加樣回收率樣品溶液的配制方法：精密稱(chēng)取本品約200 mg，置離心管中，加標(biāo)準(zhǔn)線(xiàn)性4 溶液（10 ng/ml）1 ml，用甲醇稀釋至10 ml，渦旋混勻1 min，經(jīng)0.22 μm 濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液即可，平行制備3 份。

中濃度加樣回收率樣品溶液的配制方法：精密稱(chēng)取本品約200 mg，置離心管中，加標(biāo)準(zhǔn)線(xiàn)性7 溶液（100 ng/ml）1 ml，用甲醇稀釋至10 ml，渦旋混勻1 min，經(jīng)0.22 μm 濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液即可，平行制備3 份。

高濃度加樣回收率樣品溶液的配制方法：精密稱(chēng)取本品約200 mg，置離心管中，加7 個(gè)雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備溶液（1 000 ng/ml）各1 ml，用甲醇稀釋至10 ml，渦旋混勻1 min，經(jīng)0.22 μm 濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液即可，平行制備3 份。

2.8.2 結(jié)果結(jié)果表明，低、中、高不同濃度溶液準(zhǔn)確度在86%～102%，準(zhǔn)確度良好。見(jiàn)表3。

表3 纈沙坦加樣回收率(%,n=3)

3 討論

在實(shí)驗(yàn)初期，發(fā)現(xiàn)空白溶液中NDBA 處有很大的干擾峰，查閱文獻(xiàn)[7]，發(fā)現(xiàn)該位置的干擾峰為流動(dòng)相中的水引入，為了除去該干擾物質(zhì)，在混合器與進(jìn)樣器之間連接Agilent poroshell 120EC-C18（4.6×50 mm，2.7 μm）的色譜柱，通過(guò)延長(zhǎng)該干擾峰的保留時(shí)間，使其與NDBA 完全分離[7]。

纈沙坦在水中幾乎不溶，在甲醇中易溶，所以選擇用甲醇作為溶劑，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，所有供試品相關(guān)溶液均為臨用新制。專(zhuān)屬性及精密度實(shí)驗(yàn)表明空白溶劑對(duì)各組分檢測(cè)無(wú)干擾，該檢測(cè)方法精密度良好[8]，NMBA 存在順?lè)串悩?gòu)體，其色譜峰存在肩峰，定量分析時(shí)合并峰面積進(jìn)行計(jì)算。7 個(gè)雜質(zhì)中NDBA 在最后出峰，時(shí)間為8.02 min，纈沙坦出峰時(shí)間大約為 9 min，為了保護(hù)離子源不被污染，故采集時(shí)間為0～8.2 min，之后切出質(zhì)譜。

查閱文獻(xiàn)[9-11]，現(xiàn)階段同時(shí)測(cè)定NDMA 和NDEA 的分析方法，以氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法為主；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是將色譜的高效分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度特點(diǎn)相結(jié)合的分離分析技術(shù)，既具有LC 的常溫色譜分離能力，又具有串聯(lián)質(zhì)譜的高選擇性和準(zhǔn)確性[12]，且靈敏度更高，離子源種類(lèi)也更多，檢測(cè)樣品時(shí)，APCI 電離后的響應(yīng)更大，背景干擾更小，基質(zhì)誘導(dǎo)離子抑制效應(yīng)更小，因此使用APCI 的基質(zhì)干擾更小，更有利于N-亞硝胺類(lèi)的定量分析[13]。該方法靈敏準(zhǔn)確，專(zhuān)屬性強(qiáng)，可用于纈沙坦原料藥中7 個(gè)亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)的定性與含量測(cè)定，為生產(chǎn)企業(yè)和藥品監(jiān)督部門(mén)進(jìn)行質(zhì)量控制提供有效保障。