基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究桂冰腰痛栓治療腰椎間盤突出癥的作用機(jī)制

代 倩 蔣桓宇 馮銀豪 杜霽航 金 龍 羅 建

腰椎間盤突出癥是以腰椎間盤纖維環(huán)破裂，髓核壓迫神經(jīng)根，神經(jīng)根出現(xiàn)水腫等病理改變?yōu)樘卣鞯囊环N常見臨床疾病，以腰痛、下肢坐骨神經(jīng)放射痛、行動(dòng)受限等為主要癥狀[1]。治療方法除手術(shù)外，非甾體類抗炎藥，中藥口服以及推拿手法、針灸都是臨床常用且有效的方法。

桂冰腰痛栓是醫(yī)院研發(fā)的院內(nèi)制劑，由川烏、肉桂、姜黃、白芍、麝香、冰片組成，前期的臨床研究表明桂冰腰痛栓配合推拿手法可以取得確切的臨床效果[2]。但對(duì)于其具體的分子生物機(jī)制尚不明確，基于此，本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法對(duì)桂冰腰痛栓干預(yù)腰椎間盤突出癥的分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行預(yù)測，以獲得潛在的靶點(diǎn)、通路等信息，對(duì)未來的臨床、動(dòng)物研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 有效成分的獲取和靶點(diǎn)的篩選

通過挖掘中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP）[3]尋找桂冰腰痛栓各中藥的有效成分，滿足口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.10的成分視為活性成分。由于TCMSP 未納入人工麝香的有效成分，因此本研究通過查詢文獻(xiàn)的方法尋找該味藥物的有效成分納入研究。以得到的有效成分名稱為關(guān)鍵詞在PubChem數(shù)據(jù)庫[4]下載其2D結(jié)構(gòu)文件（sdf），將結(jié)構(gòu)文件導(dǎo)入SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫[5]進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，得到桂冰腰痛栓的所有靶點(diǎn)。

1.2 腰椎間盤突出癥的靶點(diǎn)篩選

以“Lumbar Disc Herniation”為關(guān)鍵詞，通過GeneCards、TTD、Drugbank、OMIM[6-9]4 個(gè)數(shù)據(jù)庫尋找和LDH 有關(guān)靶點(diǎn)，將得到的結(jié)果進(jìn)行合并，去除重復(fù)值后得到腰椎間盤突出癥有關(guān)的疾病靶點(diǎn)。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction,PPI）網(wǎng)絡(luò)的的構(gòu)建

使用TBtools[10]進(jìn)行韋恩圖的繪制，將桂冰腰痛栓有關(guān)靶點(diǎn)作為List1，腰椎間盤突出癥有關(guān)靶點(diǎn)作為List2，取兩者交集，得到兩個(gè)List 的交集靶點(diǎn)，這一部分被視為桂冰腰痛栓治療腰椎間盤突出癥的的潛在靶點(diǎn)，因此需要獲取這一部分靶點(diǎn)直接-間接的相互作用關(guān)系。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org）[11]，設(shè)定物種為“Homo sapiens”，取中等“medium comfidence”以上的相互作用置信度（＞0.4），得到初步的PPI 網(wǎng)絡(luò)，將結(jié)果以.tsv 格式導(dǎo)入Cytoscape 3.7.3 軟件中進(jìn)行分析和美化。在Cytoscape 軟件中使用Networkanalyser 插件對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析得到各靶點(diǎn)的Degree 值、中心度，再通過Cytohubba 插件對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析得到各靶點(diǎn)的最大集團(tuán)中心度（maximal clique centrality,MCC）值，根據(jù)MCC 值篩選出桂冰腰痛栓治療腰椎間盤突出癥的核心靶點(diǎn)。

1.4 基因本體（gene ontology,GO）富集分析和京都基因及基因組百科全書（koyoto encyclopedia of gene and genomes,KEGG）通路富集分析

將潛在治療靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫[12]，設(shè)定物種為“Homo sapiens”進(jìn)行GO 富集分析和KEGG通路分析，得到這些靶點(diǎn)的生物過程、細(xì)胞成分和分子功能，KEGG 通路信息。納入P≤0.05 的項(xiàng)目，選擇P值最低的15 個(gè)項(xiàng)目繪制圈圖對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。將桂冰腰痛栓的有效成分、富集在關(guān)鍵通路上的靶點(diǎn)、關(guān)鍵通路的信息導(dǎo)入Cytoscape 軟件建立成分-靶點(diǎn)-通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析得到發(fā)揮作用的核心成分。

1.5 成分靶點(diǎn)通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

使用cytoscape軟件將得到的15個(gè)最有可能是桂冰腰痛栓發(fā)揮治療作用的通路和富集在這些靶點(diǎn)上的基因、與這些基因相關(guān)的有效成分這三者的關(guān)系繪制成網(wǎng)絡(luò)圖，并使用內(nèi)置的Networkanalyser 對(duì)其進(jìn)行分析得到網(wǎng)絡(luò)相關(guān)的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，用以預(yù)測核心靶點(diǎn)和發(fā)揮藥效的主要成分。

2 結(jié)果

2.1 桂冰腰痛栓和腰椎間盤突出癥的靶點(diǎn)獲取

在TCMSP 經(jīng)過篩選有44 個(gè)成分滿足OB≥30%，DL≥0.10，通過文獻(xiàn)檢索人工麝香獲得8 個(gè)有效成分，共得到桂冰腰痛栓有效成分52 個(gè)。其中姜黃和肉桂具有一個(gè)相同的有效成分α-柏木烯。見表1。將44 個(gè)有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)文件導(dǎo)入Swiss Target Prediction 后獲得1 925 個(gè)靶點(diǎn)，去除重復(fù)值后得到525 個(gè)靶點(diǎn)。基于GeneCards、TTD、Drugbank、OMIM 4 個(gè)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)挖掘得到腰椎間盤突出癥相關(guān)基因431 個(gè)。隨后使用TBtools 將兩個(gè)靶點(diǎn)集合并取交集。見圖1。得到交集靶點(diǎn)共54 個(gè)，這54 個(gè)基因被視為桂冰腰痛栓治療腰椎間盤突出癥的潛在靶點(diǎn)。

圖1 桂冰腰痛栓和腰椎間盤突出癥的靶點(diǎn)韋恩圖

表1 桂冰腰痛栓有效成分

續(xù)表1

2.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析

將54 個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫中，得到的結(jié)果以.tsv 格式導(dǎo)入Cytoscape 進(jìn)行分析和美化，得到桂冰腰痛栓治療腰椎間盤突出的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。使用Cytohubba 分析該網(wǎng)絡(luò)，得到MCC 最高的前10 個(gè)靶點(diǎn)作為PPI 網(wǎng)絡(luò)的核心靶點(diǎn)，其中排名前10 的靶點(diǎn)依次為AKT1、VEGFA、IL-6、MMP9、TNF、PTGS2、MAPK1、MAPK8、MMP2、JUN。見圖3。可以看出，使用MCC 值得到的10 個(gè)靶點(diǎn)和使用Degree 值預(yù)測的核心靶點(diǎn)有所不同，但大體一致。

圖2 PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖3 MCC 值最高的10 個(gè)核心基因

2.3 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析

使用Metascape 平臺(tái)對(duì)54 個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行生物富集分析，發(fā)現(xiàn)這54 個(gè)靶點(diǎn)參與1 560 個(gè)生物過程，富集于22 個(gè)細(xì)胞成分，具有77 個(gè)分子功能。根據(jù)Metascape 平臺(tái)自動(dòng)計(jì)算的P值，選取P值最低的前15 個(gè)條目以圈圖的形式進(jìn)行可視化。見圖4。桂冰腰痛栓主要參加的生物學(xué)過程有肌肉細(xì)胞增殖、腺體發(fā)育、上皮細(xì)胞增殖、對(duì)脂多糖的應(yīng)答、對(duì)細(xì)菌來源分子的應(yīng)答、對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控。這些靶點(diǎn)發(fā)揮作用的場所主要位于膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等。相關(guān)靶點(diǎn)治療腰椎間盤突出癥的功能主要富集于絲氨酸水解酶活性、內(nèi)肽酶活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、絲氨酸型肽酶活性等。

圖4 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析結(jié)果

KEGG 通路富集分析共得到146 條通路，其中P值最低的通路為腫瘤壞死因子通路、松弛素信號(hào)通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、白細(xì)胞介素-17 信號(hào)通路等。

2.4 成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

使用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建出桂冰腰痛栓-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。雄激素受體（androgen receptor,AR）的Degree 值為29，betweenness 為0.32，closeness為0.41，因此根據(jù)Degree 值預(yù)測AR 為相對(duì)重要的靶點(diǎn)，SLC6A4、MAPK14、ESR1、AKT1 等亦為重要的靶點(diǎn)。亞油酸Degree 值最高為9，betweenness為0.10，closeness 為0.42，因此桂冰腰痛栓治療腰椎間盤突出癥的主要成分為亞油酸。其次為α-柏木烯（(-)-alpha-cedrene），其Degree 值為6，betweenness為0.0039，closeness 為0.32。見圖5。

圖5 桂冰腰痛栓治療腰椎間盤突出癥的成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

3 討論

本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測出桂冰腰痛栓治療腰椎間盤突出癥的主要有效成分可能為亞油酸、α-柏木烯、油酸、β-谷甾醇。亞油酸是人類飲食中攝取最多的多不飽和脂肪酸，作為磷脂膜的主要結(jié)構(gòu)成分之一在維持膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。近期研究表明，大劑量的亞油酸可以有效逆轉(zhuǎn)棕櫚酸誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[13]。共軛亞油酸可通過調(diào)節(jié)環(huán)氧化酶-2（COX-2）的活性和表達(dá)以影響前列腺素E2（PGE2）的合成，從而增加骨形成率，緩解炎癥[14]。α-柏木烯作為一種MOR23 的天然配體，可以減輕游離脂肪酸誘導(dǎo)的骨骼肌管的萎縮，增加肌管直徑、融合指數(shù)和細(xì)胞總蛋白含量；而敲除MOR23 后增強(qiáng)骨骼肌強(qiáng)度和質(zhì)量的效應(yīng)明顯減弱[15]。β-谷甾醇可以通過抑制NF-κB 通路和激活HO1/Nrf-2 通路以降低NF-κB、RANKL、STAT3 水平，從而影響炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-16、TNF-α、IL-6水平而緩解小鼠的關(guān)節(jié)炎癥[16]。

本研究結(jié)果表明AKT1 是桂冰腰痛栓治療腰椎間盤突出癥的潛在靶點(diǎn)。AKT1 是一種受磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）信號(hào)調(diào)節(jié)的絲氨酸-蘇氨酸激酶，可以抑制神經(jīng)元凋亡[17]。AKT1 在調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞大小和存活方面具有多種作用[18]，包括加速軸突再生，促進(jìn)軸突伸長和分支等。因此推測桂冰腰痛栓可通過調(diào)節(jié)AKT1 以改善腰椎間盤突出造成的神經(jīng)損傷以及促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)。

炎癥反應(yīng)在腰椎間盤突出癥中發(fā)揮著重要的作用，TNF 是一種參與全身系統(tǒng)性炎癥的重要細(xì)胞因子之一，TNF-α 可以上調(diào)多種細(xì)胞黏附分子如細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子1（VCAM-1）等從而促進(jìn)炎癥發(fā)生[19-20]。本研究預(yù)測出的其他幾個(gè)重要基因包括VEGFA、IL6、TNF 等都參與了炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生過程，調(diào)控炎癥應(yīng)是桂冰腰痛栓治療腰椎間盤突出癥的重要機(jī)制。

綜上所述，桂冰腰痛栓具有多種有效成分，且多種有效成分可以調(diào)控多個(gè)基因，參與多個(gè)信號(hào)通路，且這些有效成分、基因、通路之間的關(guān)系并非一一對(duì)應(yīng)，而是相互交錯(cuò)形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，這體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療疾病的多靶點(diǎn)、多通路的關(guān)系。同時(shí)，這也為進(jìn)一步研究中醫(yī)藥的分子生物學(xué)機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。本研究的局限性在于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)本身基于計(jì)算機(jī)科學(xué)和數(shù)據(jù)庫的挖掘，不能納入未知有效成分如中藥復(fù)方制劑生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)，以及未知的有效成分-基因-通路之間的關(guān)系。因此需要在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步篩選動(dòng)物、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證從而明確桂冰腰痛栓治療腰椎間盤突出癥的作用機(jī)制。