關于當歸炮制后新產生成分如何分離及結構鑒定

劉偉

中藥當歸是臨床上應用較為普遍的補血藥物,其味甘、性辛溫,可歸肝、心、脾經,入藥后能夠發揮良好的補血效果,其不僅在血虛所致的多種癥狀中發揮效果,同時也能發揮活血、止痛、補血等功效,為婦科調經治療的首選藥物［1］。炮制則是現階段應用十分廣泛的一種中藥臨床用藥手法,當前臨床上當歸炮制品應用種類繁多,其中較為常見的炮制品包含生當歸、酒當歸以及土炒當歸等多種類型［2］。中藥炮制主要是一種依據中醫臨床用藥需求及藥物自身性狀,并結合調劑、制劑方法的差異對藥物進行加工處理的制藥技術［3］。對于當歸炮制后成分的鑒定與明確則是確保其臨床用藥安全性的重要手段,但在采取不同炮制方法的情況下,其臨床效果也有一定差異,新產生成分的化學成分也不一樣,這對于臨床用藥藥物的藥性研究十分關鍵,且單單依據氣味、顏色難以辨別,故為了有效確保其使用效果及安全性,采取合理手段明確當歸炮制后新產生的成分十分重要［4,5］。對此,本文主要分析當歸炮制后新產生成分的分離方式及結構鑒定?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 研究中選取儀器試劑主要為核磁共振儀(產自瑞士；AVANCE Ⅲ；500 MHz)；液相色譜儀(產自美國Asi-lent；Agilent1200)；制備型高效液相色譜儀(產自美國Asi-lent；Agilent1100)。研究中應用材料主要包含柱層析硅膠(產自青島海洋化學廠；100-200 目、200-300 目)；當歸生品(產自浙江中醫藥大學中藥飲片廠)。

1.2 方法

1.2.1 當歸炮制前后圖譜對比 針對此次研究中生當歸炮制后新產生成分主要經高效液相色譜法(HPLC)圖譜發現,當歸炮制過程如下：稱取40%干燥60 目生品當歸及1 g 制品粉末,將其置于圓底燒瓶(50 ml)中,注入50 ml 甲醇(CH4O)在水浴(80℃)環境下回流60 min,抽濾并使用10 ml CH4O 分次對瓶壁及濾渣進行洗滌,此后合并濾液,減壓濃縮；針對殘渣使用CH4O 溶解,并將其定容到容量瓶(5 ml),從而得到當歸生品及制品樣品。使用微孔濾膜(0.22 μm)進行過濾,取續濾液,予以10 μl 進樣,并進行HPLC 分析,得到色譜圖如圖1(炮制前)、圖2(炮制后),對比炮制前后色譜圖可見,色譜峰1、2 為炮制后新得到的產物。

1.2.2 提純分離 制取4 kg 當歸,加入95%的乙醇(EtOH)60 kg(當歸的15 倍量)；加熱回流提取2 次,提取時間為90 min/次,提取液回收至無醇味,加入水適量以分散,并分別應用石油醚(C7H16)、乙酸乙酯(C4H8O2)和正丁醇［CH3(CH2)3OH］進行萃取,C4H8O2萃取物(80 g)通過硅膠柱色譜,使用C7H16-C4H8O2梯度洗脫,得到洗脫部位1、2,前者應用制備液相(H2O-CH4O 為流動相)分離,獲得化合物A；后者采取重結晶分離,獲得化合物B 與C。

2 結果

2.1 化合物A 經觀察鑒定,化合物A 為微黃色油狀物,經10%的硫酸(H2SO4)顯色(于硅膠薄層板上)后,呈墨綠色。具體色譜資料見表1。結合波譜數據及相關文獻研究顯示,化合物A 與5-HMF 高度一致,故鑒定為5-HMF。分離后結合相同色譜條件進行高效液相分析,顯示圖2 色譜峰2 為5-HMF。

表1 化合物A 色譜分析結果

2.2 化合物B 化合物B 為白色針狀結晶(CH4O),經溴甲酚(C21H14Br4O5S)綠反應呈現陽性,提示可能含有羧基；經三氯化鐵(FeCl3)反應呈現陽性,顯示可能存在酚羥基。具體色譜資料見表2。結合上述理化性質及波譜數據分析可見,該化合物結構與香草酸(C8H8O4)高度一致,故分析其為香草酸。

表2 化合物B 色譜分析結果

2.3 化合物C 化合物C 表現為白色結晶,通常為針狀,其于溴甲酚綠(C21H14Br4O5S),發生化學反應后,呈現陽性,故表明存在羧基。ESI(+)-MS 得出結果(m/z124［M+H］+)。則表明分子中有C=O；80［M+HCO2］則表明分子中存在-COOH。1H-NMR (500 MHz,DMSO-d6)譜給出質子信號5 個,峰形較寬,結合色譜顯示可能為羰基信號,推測為羧基氫信號；9.114 為吡啶環上連接雜原子的碳上質子信號；8.854、8.303、7.573構成吡啶環上3 個相鄰質子偶合系統。C-NMR 譜給出碳信號6 個,δ166.35 為羧基碳信號,其余5 個位連接雜原子的碳信號。結合上述分析可推斷該化合物的構成為連接1 個吡啶環、1 個羧基。結合上述理化表現及波譜數據顯示其與煙酸(C6H5NO2)基本一致,故分析化合物C 為煙酸。

3 討論

當歸是中醫臨床上應用較為普遍的一味中草藥,其為多年生草本植物,主要產自甘肅東南部［6］,多用于中醫治療,具有極高的藥用價值,臨床上多將其應用于心臟、心血管等疾病的治療中,具備抗氧化、抗炎癥及抗血小板聚集等多種功效［7］。目前,臨床上主要通過中醫炮制形式對當歸的功效進行明確,從當歸炮制方式來看,臨床上主要有酒當歸、當歸炭及當歸土炒等形式［8］。相關研究資料顯示,當歸中包含的水溶性及揮發性物質是其主要成分,水溶性成分多為阿魏酸,揮發性成分主要為揮發油及總鞣質等［9］。同時也有相關研究顯示,采取不同的方法進行炮制后得到的藥品質量也存在一定的差異,并對其成分質量有一定影響［10］。目前在當歸中包含的已知化合物主要包含香草酸與煙酸,而5-HMF 則是當歸炒制中產生的一種新成分［11］；在當歸中包含糖,故在其處于酸性環境及高溫條件下則會導致多糖水解為單糖,進一步處于酸性環境下則會脫水形成5-HMF。經分離得到的5-HMF進一步純化后,經薄層色譜法(TLC)、HPLC 檢查可見,其含量高于98%［12］。結合此次研究分析可見,在當歸炒制后共產生新物質為2 種化合物,通過分離提純得到其中一個為5-HMF,另一個未能得到,經HPLC 色譜圖分析可見,其出峰時間早于5-HMF,這顯示其對比5-HMF 的極性更大,結合圖譜及理化分析可見,其可能含有羥基、羰基。既往有研究人員發現,在中藥材何首烏進行炮制后,新產生了兩種化合物,經分離提純后鑒定顯示其一為5-羥基麥芽酚,其二為5-HMF。在HPLC 色譜中顯示5-羥基麥芽酚對比5-HMF 出峰時間更早,經質譜得出其分子量為144。結合這一研究認為分離得到的兩種物質可能為麥拉德反應產物,即為單糖與蛋白質或氨基酸在某種條件下經一系列化學反應及結構轉化形成的新產物。故分析在當歸炮制后產生的新增化合物可能為5-羥基麥芽酚,但具體產物分析還有待進一步深入探析。

綜上可見,在當歸炮制后得到的產物主要有3 種,即為5-HMF、香草酸與煙酸,其中5-HMF 為當歸炮制后得到的新化合產物之一,而針對實驗中產生的另一新產物仍需進一步研究加以鑒別。