聚類肽的合成方法及性能研究進展*

王筑城，魏玉函，王存國

(青島科技大學橡塑材料與工程教育部重點實驗室 山東省橡塑材料與工程重點實驗室，山東 青島 266042)

近年來，隨著合成技術不斷創新發展，人們對環狀聚合物的研究從原先的環狀聚合物材料的基本性質和理論模型的構建開始轉向功能性環狀聚合物的合成，聚類肽又稱氮取代聚甘氨酸(N-Polyglycine)就是其中之一。對聚類肽研究最早的是Kukula等[1]科學家，早在1926年，率先對聚N-甲基甘氨酸(Poly N-methylglycine，PNG)進行了研究，發現其存在于人體肌肉等部位，并發現了肌氨酸(Sarcosine N-carboxyanhydride，SNCA)在氮原子上缺少氫原子的情況下仍然會在吡啶作用下發生聚合等現象。1950年，Sun等[2]在上述研究基礎上有重大突破，合成出了一種易水解且取代基不同的N-羧酸酸酐(N-carboxylic anhydride，NCA)；1956年，Zhang等[3]發現了聚肌氨酸(PSar)的免疫原性極小的特點，從而開始了聚類肽的研究。21世紀初，PSar被合成出來，并開始應用于生物醫學方面[4]，而且Kuemin等[5]研究了Sar-NCA的合成機理，并探索出了用固相法合成聚類肽的實驗路線。

1 聚類肽的結構

聚類肽結構可以通過鍵與側基二級空間結構的相互改變形成穩定的一級空間結構,與一般聚肽通過鍵與氫鍵相互作用形成二級空間結構不同,這是由于聚類肽沒有氫鍵相互作用決定的。經過大量研究，了解到聚類肽PSar和其他非類似手性側基的兩類聚類肽同樣會表現出一種無規線性基團構象，具有類似手性側基的聚類肽，如聚脯氨酸，有PPⅠ和PPⅡ2種螺旋構象。只要直接在這類聚類肽側鏈引入手性基團，便得到類似的螺旋構象。Guo等[6]利用R-NCA的開環聚合得到了許多手性基團為側基的環狀和線性聚類肽，通過測試得知二者都具有螺旋結構(見圖1)。

圖1 PPⅠ和PPⅡ2種螺旋構象

2 聚類肽的合成方法

2.1 固相合成法

聚類肽的固相合成法由Dewey首先提出[7](見圖2)，具體步驟是在固定支架的肽鏈上加入含有氨基保護能力的氨基酸基團制備規整序列的肽鏈。一些納米管狀材料由該方法制備，但操作步驟繁瑣，所需試劑昂貴，并且合成的肽鍵長度也有局限。1992年，Simon等[8]提出了另一種亞單體合成法，簡化了制備規整肽鏈的固相合成所需要的復雜步驟，使用該方法不僅提高了合成效率而且同時獲得了調控聚類肽序列的能力。亞單體合成法的合成過程(見圖3)分為兩步。(1)溴乙酸分子在N,N′-二異丙基碳二亞胺(DIC)的作用下，與承載溴乙酸的樹脂載體末端的仲胺發生酰化反應；(2)位于樹脂載體內部末端的一個溴原子與伯胺發生SN 2親核取代反應，使樹脂載體末端再次轉化為仲胺，繼續與溴乙酸發生乙酰化反應。不斷重復上述2個過程可得到不同序列的類肽材料。

圖2 亞單體序列可控聚類肽的固相合成法

圖3 聚類肽亞單體固相合成法

2.2 開環聚合法

開環聚合法一般是指將NCA單體通過開環進行聚合的方法(見圖4)，NCA開環聚合是目前合成大量聚類肽材料所使用的一種主要方法，具體是先合成開環聚合所用的原材料NCA，然后環狀NCA再進行開環聚合。開環聚合法具有合成操作簡便、合成產物產率高、可控性好等優點，可以得到高分子量和窄分布的聚合物。1906年，Aubert首先合成了NCA[9]，后來，Bailey等[10]相繼合成出了高分子量的聚肽，從而引起了NCA的合成技術熱潮。時至今日，NCA已經發展衍生出了嵌段、枝狀、星型等多種拓撲結構，借助紅外光譜(FTIR)、差熱分析(DSC)和顯微鏡等測試方法，使人們對NCA合成多肽的合成機理和催化體系有了更深的認識。

圖4 R-NCA的開環聚合

Zhang等[11]用引發劑NCA制備了環狀均聚和嵌段的聚類肽，并且研究了其聚合機理和物理性能。Luxenhofer與其同事使用固相載體引發開環聚合氮取代的NCA，并且研究了產物的溶解性、熱性能和生物相容性。因NCA五元環上有氫鍵供體(—NH—)存在，NCA極易吸收空氣中的水分而變得不穩定。并且，NCA在聚合過程中會產生使分子量分布(PDI)變寬的副反應。在過去很長一段時間內，金屬硅酸鹽和金屬氧化物一直是主要的NCA合成所使用的催化劑和引發劑，并在引發酸酐聚合時發揮“堿催化”機理，作主催化劑進行聚合時要具備特定的干燥或真空環境，這意味著催化劑對反應條件的要求很高，必須在無水無氧的條件下進行，且含有的金屬物質會對之后的提純和生物醫藥方面的應用造成不利影響。Tao等[12]提出了一種使用伯胺作為引發劑引發NCA聚合的方法，得到分散性低、產率高的聚合物，但缺點是以此為催化劑的反應速度較慢。之后，Hadjichristidis[13]提出使用伯胺作為引發劑，利用真空技術實現聚合，以此減少鏈轉移終止等影響，但真空條件要求十分苛刻，實用性較差。

自從20紀初首次合成了NCA，進行了大量的研究，發現可以采取選擇含有烷氧羰基的氨基酸與部分鹵化試劑反應或使用α-氨基酸與光氣混合后的聚合反應(Fuchs-Farthing法)合成NCA。但由于光氣的毒性和污染性很強，而且光氣的儲存和控制對環境條件要求很苛刻，逐漸開始使用雙光氣和三光氣來替代，從而達到降低毒性的目的。目前，比較多的合成NCA的方法主要是采用側基被保護的氨基酸與二、三光氣在四氫呋喃(THF)中同時進行反應，制備具有氮-羧基結構的環內羧酐。該方法也有不少缺陷，最嚴重的是在NCA的合成過程中會有很多副產物產生，如鹽酸、氨基酸鹽酸鹽和異氰酸基酰氯等物質，這些副產物會抑制甚至終止NCA的鏈增長，從而對NCA的聚合過程產生很多不利影響。目前，NCA的純化方法比較統一，公認采用重結晶的方法，如果制備少量的NCA，不采用重結晶法而用柱層分析法，同樣可以達到提純效果，即采用不同的氨基酸在不同溶劑中加入引發劑或催化劑方法，引發NCA開環聚合，進而制備聚類肽材料。這種方法節約成本，可以控制分子量分布，而且分子的手性中心消旋化現象大幅度減少，便于聚氨基酸的合成與制備，但該方法合成的聚類肽也有缺陷，會導致分子序列特異性的減少和多肽單分散性的降低。

3 聚類肽的性能

聚類肽性能中比較重要的是聚類肽在溶劑中的溶解性，由于聚類肽分子結構中氮原子上的氫被其他基團取代，分子鏈間氫鍵的相互作用將不復存在，從而使聚類肽的溶解性得到大幅度提高。

Birke等[14]進一步研究了碳原子數不同的烷基鏈取代基聚類肽的性能，測試聚類肽在不同烷基鏈取代后在溶劑中溶解性的變化。PSar可以看作是以1個碳原子作為取代基的聚類肽，有著很好的水溶解性，而且還發現PSar水溶解能力的上限無法被測得，甚至可以與水在一些特定條件下以任意比例互溶。碳原子數增多后，以2個碳原子為側基取代基的聚N-乙基甘氨酸(PNEG)的水溶性就會下降。當碳原子增多到3個[即聚N-丙基甘氨酸(PNPG)]，以3個碳原子為側鏈，其水溶性更是遠遠不如上述2種物質。當碳原子數增至4個，以4個碳原子為側鏈的聚N-丁基甘氨酸(PNBG)則完全不溶于水，該團隊還測定了上述提及的聚類肽在其他溶劑中的溶解性。由此可見，隨氮原子上取代基的不同，聚類肽由于結構上的差異會表現出不同的溶解性。PSar只可以溶解在極性很強的溶劑中，隨著側鏈的結構變化，聚類肽在極性一般的溶劑中也有了較好的溶解性。

由于從聚類肽結構中發現氮原子上沒有氫存在，所以聚類肽無法形成類似多肽的在氫鍵相互作用下的二級結構。但聚類肽也有許多長處，如聚類肽的側基可以被修飾，可以通過改變空間構型，使其形成同樣穩定的二級結構。PSar在水溶液中的溶解性十分優良，并且結構會呈現出無規線團構象。其結構不同的原因是因為酰胺鍵存在著順反異構現象。因此，由以上可以推測出如果在側基引入手性基團結構，可能也會形成和上文類似的螺旋結構。目前，對聚類肽的研究還處于起步階段，對PSar之外的材料的了解還不是很深刻，聚類肽的很多基本性質還有待進一步探究。

3.1 聚類肽的溶解性

溶解性是材料最重要的性質之一，對作為可以應用在生物醫用方面的聚類肽來說就顯得更加重要。因為聚類肽結構中沒有氫鍵作用，所以聚類肽在絕大部分溶劑中的溶解性都遠好于聚肽。例如作為聚肽的谷甘氨酸的溶解性非常差，但作為聚類肽的PSar卻能夠很好地溶解在水和絕大多數極性溶劑中。

Song等[15]研究了不同長度側鏈的聚類肽在溶劑中的溶解性，其中PSar的水溶性十分出色，甚至無法測量出其在水中的溶解極限。但是隨著基團側鏈長度的變長，水溶性卻逐漸變差，例如聚乙基甘氨酸的水溶性還比較好，聚丙基甘氨酸的溶解性就較差，至于聚丁基甘氨酸則完全不溶于水。對于聚類肽在一些有機溶劑中的溶解性，研究發現取代基上有氮原子時，聚類肽在不同有機溶劑中的溶解性相差很大，例如PNEG可以溶解在絕大部分有機溶劑中，PSar可以溶解在強極性溶劑中，而PNBG只有在氯仿之中才能溶解。

3.2 聚類肽的抗菌性能

近年來，用于抵抗病菌的抗菌肽(Amtimicrobial Peptides,AMPs)越來越受到關注，抗菌肽是可以從生物體內找到并提取出來的聚類肽，這意味著其生物相容性十分優異，加之抗菌能力，使其越來越受到重視。但AMPs也有著諸如在生物體內利用率低、結構穩定性差及結構在循環時容易發生分解等缺點，從而限制了其在生物醫學領域中的應用[16]。聚類肽與AMPs的分子結構類似，主鏈結構相同，并且具有比AMPs高得多的穩定性，同時還兼有AMPs的優點，比如廣譜抗菌性和抗耐藥性等。

2008年，Huang等[17]發現了一種含有陽離子的抗菌聚類肽，該聚類肽分子具有螺旋結構，這使得該抗菌肽的最小抑菌濃度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)和細胞毒性遠低于一般聚類肽。2012年，Mojsoska等[18]報道了一種類似環狀抗菌聚類肽，抗菌性能優異，還證明了具有螺旋結構的環狀類肽的抗菌性能優于不具有螺旋結構呈線形的類肽分子。2015年，Statz等[19]合成了20種含陽離子的抗菌型聚類肽分子，并系統性地研究了抗菌型聚類肽分子結構，以及結構中電荷分布對于聚類肽抗菌性能的影響。

3.3 聚類肽的溫敏性

Zhang等[20]在2012年首先制備出了具有溫度敏感性能的聚N-乙基甘氨酸-r-N-丁基甘氨酸，同時發現了該聚類肽在水溶液中有著可逆相轉變行為和臨界溶解溫度行為(LCST)，并通過進一步研究發現聚類肽的結構和聚合物濃度以及鹽離子都會對溫敏性產生影響；在其他結構環境相同的條件下，環形結構聚類肽比線型結構聚類肽的溫敏性要低很多，并且還可以通過調節聚合物的組成和利用鹽溶和鹽析作用改變溫敏性，值得注意的是，物質的分子量卻對溫敏性影響很小。

然而，Robinson等[21]卻提出了相反的意見，分析了諸如PNPG、聚N-烯丙基甘氨酸(PNAG)、聚N-異丙基甘氨酸(PNIPG)等一系列聚合物，得出了與以上相反的結論，即其分子量會對聚類肽溫敏性能產生很大影響。制得了一種聚肌氨酸-b-聚N-癸基甘氨酸(PSar-b-PNDG)，可以通過改變結晶度改變溫敏性的凝膠。這種以PSar-b-PNDG為基體的材料在室溫下的甲醇溶液中是以凝膠狀態存在，隨著溫度的升高，會逐漸溶解，當溫度從高溫降低至室溫時，溶解的物質又能轉變為凝膠。由此證明了PNDG具有結晶性，室溫時PNDG處于晶態，但晶區會隨著溫度升高而溶化，就會觀察到凝膠-溶膠轉變。

3.4 聚類肽表面防污性

表面防污性是生物材料的重要特性之一，一般采用在材料的表面上進行修飾提高表面防污性，也可以利用材料表面修飾防止表面吸附蛋白質等物質，從而減少細胞的非特異性黏附。Stayz等[22]首先使用了多巴胺衍生物將材料表面附著上聚類肽，從而研究聚類肽的防污性。先期使用寡聚N-甲氧乙基甘氨酸進行實驗，結果較為理想，聚類肽表面防污的有效性可以持續約半年；但當對不同側鏈結構的聚類肽進行測試時，不同側鏈結構的聚類肽的防污性很差。另外，還研究了聚類肽材料在蛋白質表面上的占比和聚類肽的聚合度對聚類肽防污性是否有影響，得出的結論是只有擁有一定數量重復單元的聚類肽才會有表面防污性。

3.5 聚類肽的生物相容性

由于聚類肽常被用在生物醫藥領域，所以對生物相容性要求較高。聚類肽與聚肽性質相似，其生物相容性也較好。Li等[23]對聚類肽的生物相容性進行了大量研究，發現了聚類肽能夠抑制抗原在生物體內的免疫性應答，自身能夠在生物體內穩定存在；另外還研究了聚類肽的生物毒性，通過將人體細胞放在聚類肽中培養后成功存活，證明聚類肽有著極低的生物毒性。

3.6 聚類肽的自組裝

自組裝廣義上是指高分子與高分子間、高分子與小分子間或高分子與基底間產生的相互作用，依靠非共價鍵合而實現不同結構的現象。自組裝的另一種說法是組裝單元在氫鍵、靜電相互作用或者在范德華力等弱共價鍵作用下，自動形成特定結構的過程。生物體內的自組裝現象十分普遍，是構成各式各樣生命體的基礎。高分子材料的自組裝自20世紀中葉以來就越來越受到人們的廣泛關注，相關研究也愈發成熟，并取得了很多突破，自組裝已經成為制備具有規整結構、功能性納米材料的主要手段。目前，涉及到的自組裝主要有兩親性嵌段共聚物的自組裝等。

聚類肽具有和蛋白質相似的結構特征，也和蛋白質一樣有結構可調控性，這意味著可以使用聚類肽制備功能化超分子組裝體，具有重要意義。Olivier等[24]合成了同時含有正電和負電基團的聚類肽分子，而且這些分子有著不同疏水基團序列，并使用這些聚類肽分子在水溶液中制備出了厚度僅為幾納米的超薄納米片結構，又通過Langmuir-Blodgett film(LB)膜分析儀器研究了聚類肽自組裝過程。

Lahasky等[25]采用開環聚合方法制備了基于PSar的兩嵌段共聚類肽，在水溶液中制備了球形和圓柱形膠束，并且進一步研究了時間對膠束形貌有無影響，發現靜電和分子內氫鍵的相互作用會對超螺旋結構的形成有重要影響。

自組裝的主要影響因素有聚合物的分子量、結晶性、溶液種類及溶液濃度等。另外，外界環境的變化也會對自組裝產生影響。比如外界溫度、濕度和光強等。聚類肽的自組裝動力主要依靠聚類肽主鏈里的酰胺結構產生的偶極相互作用。在對自組裝行為的探索過程中，發現許多共聚物都可以作為自組裝單元形成各種各樣的穩定結構，為自組裝的發展開辟了新途徑，比如氫鍵誘導大分子自組裝、靜電作用誘導大分子自組裝、剛性鏈誘導大分子自組裝、外界條件誘導大分子自組裝和結晶驅動自組裝等。

4 結束語

對聚類肽的合成方法及性能進行了綜述，詳細介紹了聚類肽的物理化學性能，如聚類肽的溶解性、抗菌性、聚類肽的溫敏性、表面防污性、生物相容性及自組裝等，但對聚類肽的研究還處于剛剛起步，更多的性能拓展和合成方法還有待進一步探索，希望聚類肽早日開發和利用，并為人類所造福。