Mtb感染Ⅱ型肺泡上皮細胞來源外泌體通過miR-145對巨噬細胞極化的影響

李建軍，吳素方，白豐璽

肺結核（pulmonary tuberculosis，PTB）是一種由結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染引起的慢性呼吸系統傳染?。?-2］。肺泡巨噬細胞（alveolar macrophage，AM）是肺內主要的免疫細胞，可對Mtb進行免疫調節和免疫清除［3-4］。AM與肺結構細胞存在密切聯系，特別是Ⅱ型肺泡上皮細胞（type Ⅱalveolar epithelial cell，AECⅡ）能夠以接觸依賴性或非接觸依賴性方式調節肺中AM的免疫反應［5］；AECⅡ和AM之間的相互作用可調節和（或）塑造AM 的 表 型，以 應 對 損 傷［6］。另 外，外 泌 體（exosomes，Exos）在細胞間信號的傳遞中起著關鍵作用。近年來，Exos 中的微小RNA（microRNA，miRNA 或miR）成為研究熱點［7］。研究顯示，用脂多糖處理AEC 可上調AEC 來源Exos 中miR-92a-3p的表達，進而通過將炎癥信號傳遞給活化的AM 來引發肺內炎癥反應［8］。Exos介導的miRNA遞送是一種治療肺部炎癥反應的新方法［9］。本研究使用miRNA 測序對正常AECⅡ來源的Exos（AEC-Exos）和Mtb 感染AECⅡ來源的Exos（Mtb-AEC-Exos）中差異表達的miRNAs 進行鑒定，并篩選出與炎癥反應有關的miR-145，進一步評估了miR-145 在Mtb-AEC-Exos中的表達及其對AM極化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 Mtb 毒株H37Rv 購自中國獸藥檢驗所；FITC標記的抗CD86抗體和PE標記的抗CD163抗體均購自美國Becton Dickinson 公司；綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達質粒購自南京雙領生物科技有限公司；CD63、CD81和熱休克蛋白70（HSP70）抗體均購自英國Abcam 公司；EdU 細胞增殖檢測試劑盒、DiO（細胞膜綠色熒光探針）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、RIPA 裂解液購自碧云天生物科技公司；TRITC標記鬼筆環肽（粉末）購自北京百奧萊博科技有限公司；miRNA cDNA 合成試劑盒購自美國Thermo 公司；TRIzol 試劑、逆轉錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix 和miRNA 熒光定量檢測試劑盒均購自日本TaKaRa 公司；白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司。Leica confocal 118 SP5共聚焦顯微鏡（德國Leica 公司）；Hitachi H-600 透射電子顯微鏡（日本Hitachi 公司）；ZetaView 納米顆粒跟蹤分析儀（德國Particle Metrix公司）；Coulter Optima TM L-80XP 超速離心機、Cytomics FC500 流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）；ABI Prism?7500型熒光定量PCR儀（美國應用生物系統公司）；iMark680 多功能酶標儀（美國Bio-Rad公司）。大鼠肺泡巨噬細胞NR8383（CL-0172）和大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞RLE-6TN（CP-R003）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 實驗1 Mtb-AEC-Exos的鑒定

1.2.1 細胞培養 NR8383培養于含有15%胎牛血清的Ham's F-12K培養基中，RLE-6TN在含有10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM 培養基中，于5%CO2、37 ℃的培養箱中培養。隔天換液，當細胞密度融合至80%左右時進行傳代。

1.2.2 Mtb毒株H37Rv培養 所有與Mtb H37Rv菌株相關的實驗均在生物安全三級（BSLⅢ）實驗室進行。Mtb H37Rv細菌在含有10%Middlebrook ADC 增菌液和0.05%Tween 80 的Middlebrook 7H9培養基中于37 ℃下培養。在對數生長期收取細菌，并以1×108個桿菌/mL 的濃度在DMEM/F-12 培養基中沉淀并重懸。然后將其等分成6 份，并儲存在-80 ℃作為工作原液備用。

1.2.3 Mtb感染AECⅡ 為了可視化Mtb感染，將AECⅡ接種在蓋玻片上，并以1∶50感染復數（multiplicity of infection，MOI）感染GFP標記的Mtb（Mtb-GFP），命名為Mtb-AECⅡ組，另設AECⅡ組（正常培養不進行感染），并在37 ℃5%CO2培養箱中培養。72 h 后，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌AECⅡ3 次并用4%多聚甲醛固定20 min，再次用PBS 洗滌AECⅡ3次，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色，在共聚焦顯微鏡下觀察。此外，在感染72 h后，使用EdU 細胞增殖檢測試劑盒在Mtb 感染的AECⅡ中檢測細胞增殖水平［10］，使用共聚焦顯微鏡拍攝圖像。

1.2.4 Mtb-AEC-Exos 的分離與鑒定 AEC Ⅱ于無血清DMEM 中在Mtb 存在的情況下培養72 h后，收集來自AECⅡ的細胞培養基，并在4 ℃下以300×g離心10 min、2 000×g離心20 min（棄沉淀，除去細胞）和10 000×g離心30 min（棄沉淀，除去亞細胞成分）；收集上清液用0.22μm 規格過濾器過濾，在超速離心機中4 ℃100 000×g離心70 min，沉淀Exos；Exos顆粒用無菌PBS洗滌，繼續在4 ℃，100 000×g離心70 min；沉淀的Exos在無菌PBS中重懸，并儲存在-80 ℃冰箱中，命名為Mtb-AECⅡ組。從正常AECⅡ培養上清液中提取的Exos（AEC-Exo）用作對照，命名為AECⅡ組。隨后使用透射電子顯微鏡（TEM）和納米粒子追蹤分析（NTA）觀察Exos形態，檢測Exos 的數量和大??；并使用流式細胞術鑒定Exos 表面特征標志物CD63、CD81和HSP70，3個指標同時有表達即表示Exos的存在；使用RIPA裂解液分離Exos中的蛋白質，并使用BCA蛋白質測定試劑盒檢測Exos的蛋白質含量。

1.2.5 Exos的miRNA微陣列檢測 miRNA微陣列研究Mtb-AEC-Exos 和AEC-Exo 之間差異表達的miRNA。使用miRNeasy Mini Kit 提取和純化總RNA。Exos miRNA 微陣列雜交、數據生成和歸一化由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。為了全面分析微陣列數據，篩選出兩者中基因變化倍數≥2 的miRNA。在miRNA 微陣列檢測后，使用miRNA cDNA 合成試劑盒合成cDNA 樣本并采用miRNA 熒光定量PCR（qPCR）檢測試劑盒進行檢測，使用2-ΔΔCt方法計算歸一化為U6后miRNA的相對表達量。

1.2.6 Mtb-AEC-Exos 在巨噬細胞中的作用 為了評估Mtb-AEC-Exos 對AM 活化的影響，用親脂性染料DiO 標記Exos，用TRITC-鬼筆環肽標記AM 的細胞骨架。AM（1×105個）接種在蓋玻片上，分為AECⅡ組和Mtb-AECⅡ組，分別與標記的Exos（AEC-Exos、Mtb-AEC-Exos）共培養24 h后，將用Exos 處理的巨噬細胞在4%多聚甲醛中固定，用0.1%Triton X-100滲透，用3%胎牛血清白蛋白封閉。然后，取200μL現配的TRITC-鬼筆環肽染色工作液，完全覆蓋蓋玻片上的細胞，室溫避光孵育30 min。用DAPI 對細胞核進行染色?？篃晒獯銣鐒┓馄?，在共聚焦顯微鏡下觀察。ELISA檢測細胞培養上清液中TNF-α、IL-6和IL-10的水平。

1.3 實驗2 Mtb-AEC-Exos對AM極化的影響及分子機制

1.3.1 細胞轉染 由上海GenePharma 公司合成miR-145 模擬物（mimic）、miR-145 沉默序列（inhibitor）及其相應的陰性對照（mimic-NC和inhibitor-NC）慢病毒載體。為了獲得過表達或沉默miR-145的Exos，用過表達或沉默miR-145的慢病毒以20 MOI 轉染AECⅡ。實驗分為：對照組、mimic-NC 組、miR-145 mimic 組、inhibitor-NC 組、miR-145 inhibitor 組。然后，參照1.2.3 和1.2.4 步驟用Mtb 感染AECⅡ并分離Exos，qPCR 檢測轉染的Mtb-AECⅡExos 中miR-145mRNA 水平。最后，將NR8383細胞分別與上述各組中的Exos（含終濃度為80 mg/L Exos的培養基）共同孵育24 h，以誘導M1或M2巨噬細胞極化。

1.3.2 流式細胞術檢測巨噬細胞M1型標志物（CD86）、M2型標志物（CD163）表達 采用流式細胞術分析CD163 和CD86陽性巨噬細胞的百分比。NR8383細胞重懸于PBS中并調整濃度為1×106個/mL，加入5 μL FITC-CD86 抗體或5 μL PECD163 抗體，在室溫下孵育30 min。使用流式細胞儀分析CD86和CD163巨噬細胞的百分比。

1.3.3 qPCR 檢測巨噬細胞中miR-145、TNF-α、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、精氨酸酶1（Arg-1）和IL-10的mRNA 水平 使用TRIzol試劑從細胞中分離總RNA，使用逆轉錄試劑盒將RNA 逆轉錄為cDNA。在Prism?7500 熒光定量PCR 儀上使用SYBR Green PCR Master Mix 進行qPCR。反應條件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個循環。U6用作miR-145的內參，mRNA水平用β-肌動蛋白（β-actin）的mRNA水平進行標準化，并表示為倍數變化。引物序列見表1。基因的相對表達水平用2-ΔΔCt法表示。

Tab.1 The primer sequence of qPCR表1 qPCR的引物序列

1.4 統計學方法 采用GraphPad Prism 8.0軟件進行數據分析。符合正態分布計量數據以±s表示。2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗1

2.1.1 Mtb感染AECⅡ與Exos的鑒定 共聚焦顯微鏡成像結果顯示，Mtb 被AECⅡ吸收，見圖1。EdU檢測結果顯示，與正常培養的AECⅡ相比，Mtb感染不影響AECⅡ的增殖（P＞0.05），見表2，圖2。Exos分離后，TEM 和NTA 分析結果顯示，Mtb-AEC 組和AECⅡ組均分泌直徑約為100 nm 的球形囊泡，見圖3；Mtb-AECⅡ組Exos 的數量高于AECⅡ組（P＜0.01），見表2。流式細胞術結果顯示，Exos中CD63、CD81、HSP70 均呈陽性表達，見圖4。此外，與AECⅡ組相比，Mtb-AECⅡ組Exos 中蛋白質含量增加（P＜0.01），見表2。

Fig.1 Image showing that Mtb was absorbed by AECⅡ圖1 Mtb被AECⅡ吸收

Tab.2 Comparison of AECⅡproliferation activity,Exos quantity and protein content between the two groups表2 2組間AECⅡ增殖活性、Exos數量和蛋白質含量的比較 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of AECⅡproliferation activity,Exos quantity and protein content between the two groups表2 2組間AECⅡ增殖活性、Exos數量和蛋白質含量的比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01。

組別AECⅡ組Mtb-AECⅡ組t Edu陽性細胞（%）42.36±5.27 45.29±5.67 0.656 Exos數量（×105/cell）1.39±0.20 2.28±0.25 4.815＊＊Exos蛋白質含量（mg/L）0.35±0.05 0.71±0.08 6.609＊＊

Fig.2 The effect of Mtb infection on the proliferation of AECⅡ圖2 Mtb感染對AECⅡ增殖的影響

Fig.3 Morphology and particle size distribution of Mtb-infected AECⅡ-derived Exos圖3 Mtb感染的AECⅡ來源Exos的形態和粒徑分布

Fig.4 Flow cytometry showing positive expression of Exos surface markers CD63,CD81 and HSP70圖4 流式細胞術檢測示Exos表面標志物CD63、CD81、HSP70陽性表達

2.1.2 Exos 的miRNA 微陣列檢測 總共評估了3 604 個Exos miRNA（圖5A），并鑒定了一組差異表達的miRNA（倍數變化＞2）。前5 個差異表達的Exos miRNA 分 別 為miR-574-5p、miR-145、miR-6124、miR-6165、miR-6760-5p（圖5B），通過qPCR驗證了4個上調miRNA的表達水平，結果顯示miR-145的表達水平增加最多，見圖5C。

2.1.3 Mtb-AEC-Exos 促進AM 活化 共聚焦顯微鏡結果顯示，AECⅡ組和Mtb-AECⅡ組中均可見綠色DiO 標記的Exos 被巨噬細胞內化，見圖6。與AECⅡ組相比，Mtb-AECⅡ組巨噬細胞培養上清液中IL-10 水平增加，TNF-α 和IL-6 的水平降低（均P＜0.01），見表3。

2.2 實驗2

2.2.1 轉染后各組Mtb-AECⅡExos 中miR-145水平比較 與對照組相比，mimic-NC 組和inhibitor-NC 組Mtb-AECⅡExos 中miR-145水平差異無統計學意義（P＞0.05），miR-145 mimic 組miR-145水平升高，miR-145 inhibitor 組miR-145水平降低（P＜0.05），見表4。

2.2.2 各組CD86 和CD163 陽性巨噬細胞百分比的比較 與對照組相比，mimic-NC 組和inhibitor-NC組的CD86 陽性和CD163 陽性巨噬細胞百分比差異無統計學意義（P＞0.05），miR-145 mimic組CD86陽性巨噬細胞百分比降低，CD163 陽性巨噬細胞百分比升高（P＜0.05），miR-145 inhibitor組CD86陽性巨噬細胞百分比升高，CD163 陽性巨噬細胞百分比降低（P＜0.05），見表4、圖7。

2.2.3 各組巨噬細胞中miR-145、TNF-α、iNOS、Arg-1和IL-10的mRNA 水平比較 與對照組相比，mimic-NC 組 和inhibitor-NC 組miR-145、TNF-α、iNOS、Arg-1和IL-10的mRNA 水平差異無統計學意義（P＞0.05），miR-145 mimic組TNF-α、iNOSmRNA表達水平降低，miR-145、Arg-1和IL-10mRNA表達水平升高（P＜0.05），miR-145 inhibitor 組TNF-α、iNOSmRNA 表達水平升高，miR-145、Arg-1和IL-10mRNA表達水平降低（P＜0.05），見表5。

Fig.5 Exos miRNA microarray detection圖5 Exos的miRNA微陣列檢測

Fig.6 Images showing that Mtb-AEC-Exos were internalized by macrophages圖6 Mtb-AEC-Exos被巨噬細胞內化

Tab.3 Comparison of TNF-α,IL-6 and IL-10 levels in macrophages between the two groups表3 2組巨噬細胞培養上清液中TNF-α、IL-6和IL-10水平的比較 （n=3，ng/L，±s）

Tab.3 Comparison of TNF-α,IL-6 and IL-10 levels in macrophages between the two groups表3 2組巨噬細胞培養上清液中TNF-α、IL-6和IL-10水平的比較 （n=3，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01。

組別AECⅡ組Mtb-AECⅡ組t TNF-α 27.40±3.39 15.56±2.61 4.793＊＊IL-6 50.62±6.45 29.14±3.38 5.109＊＊IL-10 46.81±6.23 115.20±11.04 9.344＊＊

Tab.4 Comparison of miR-145 levels and the percentages of CD86-positive and CD163-positive macrophages between the five groups表4 各組miR-145 水平與CD86陽性和CD163陽性巨噬細胞百分比比較 （n=3，±s）

Tab.4 Comparison of miR-145 levels and the percentages of CD86-positive and CD163-positive macrophages between the five groups表4 各組miR-145 水平與CD86陽性和CD163陽性巨噬細胞百分比比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與mimic-NC組比較，c與inhibitor-NC組比較，P＜0.05。

組別對照組mimic-NC組miR-145 mimic組inhibitor-NC組miR-145 inhibitor組F miR-145 1.00±0.00 1.02±0.11 3.48±0.42ab 1.03±0.10 0.35±0.06ac 108.869＊＊CD86陽性（%）40.70±5.58 41.26±5.23 22.14±3.56ab 40.95±5.18 62.43±7.02ac 21.045＊＊CD163陽性（%）55.62±7.39 57.34±8.12 80.61±9.75ab 56.59±7.26 32.28±5.03ac 14.935＊＊

Tab.5 Comparison of mRNA levels of miR-145,TNF-α,iNOS,Arg-1 and IL-10 between the five groups of macrophages表5 各組巨噬細胞中miR-145、TNF-α、iNOS、Arg-1和IL-10的mRNA水平比較 （n=3，±s）

Tab.5 Comparison of mRNA levels of miR-145,TNF-α,iNOS,Arg-1 and IL-10 between the five groups of macrophages表5 各組巨噬細胞中miR-145、TNF-α、iNOS、Arg-1和IL-10的mRNA水平比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與mimic-NC組比較，c與inhibitor-NC組比較，P＜0.05。

組別對照組mimic-NC組miR-145 mimic組inhibitor-NC組miR-145 inhibitor組F iNOS 1.00±0.00 1.01±0.13 0.62±0.08ab 1.03±0.10 2.28±0.24ac 66.299＊＊Arg-1 1.00±0.00 1.01±0.10 2.87±0.31ab 1.03±0.12 0.51±0.08ac 98.544＊＊IL-10 1.00±0.00 1.02±0.15 3.25±0.27ab 1.01±0.11 0.46±0.07ac 158.444＊＊組別對照組mimic-NC組miR-145 mimic組inhibitor-NC組miR-145 inhibitor組F miR-145 1.00±0.00 1.01±0.14 2.60±0.25ab 1.04±0.13 0.52±0.10ac 86.639＊＊TNF-α 1.00±0.00 1.03±0.12 0.54±0.09ab 1.02±0.11 3.15±0.20ac 212.628＊＊

Fig.7 CD86 and CD163 positive expression of macrophages in each group(flow cytometry)圖7 各組巨噬細胞CD86陽性和CD163陽性表達（流式細胞術）

3 討論

Mtb 感染可激活宿主的免疫防御，涉及先天免疫細胞，導致IL-1β 和TNF-α 等各種炎性細胞因子的分泌增加［11］。巨噬細胞是抵抗Mtb感染的第一道屏障，了解Mtb-巨噬細胞相互作用的潛在機制可能為結核病治療提供新的策略。除了AM，AEC最近也被認為是Mtb 感染的主要目標，其不僅具有上皮屏障功能，還可作為非專業性免疫細胞在感染反應中發揮免疫調節作用［12］。AEC可通過對感染的直接反應或調節專業免疫細胞（如AM）免疫反應的間接作用，在宿主對Mtb 感染的保護反應中發揮重要作用［13-14］。另有研究認為，AM極化參與結核病的發病過程［15-16］。AM 極化具有M1 和M2 兩個階段：M1 型的特征是炎癥反應激活，包括但不限于TNF-α類的促炎細胞因子的表達水平升高；M2型的特點是通過增加抗炎細胞因子（如IL-10）的表達來發揮抗炎作用。研究已證實，在外部刺激（包括Mtb）下，AEC可通過分泌細胞因子和介質，調節AM表型或活化［17］。目前，有關源自AEC 的Exos 對AM 極化的影響研究少見。本研究結果顯示，與AECⅡ組相比，Mtb感染AECⅡ促進了Exos 的產生，但對AECⅡ的增殖水平沒有影響；Mtb-AECⅡ被巨噬細胞吸收后可通過增加IL-10 水平，減少TNF-α 和IL-6 的產生來誘導AM 的抗炎反應；表明Mtb 刺激AEC 來源的Exos 可誘導AM 向M2 極化，但其對AM 極化的調控機制尚不清楚。

Exos 可攜帶lncRNA、miRNA、mRNA 和其他分子，是不同細胞之間的重要信使，在包括結核病在內的許多疾病的發展中發揮關鍵作用。研究顯示，感染Mtb 會導致Exos 中部分miRNA 表達水平發生顯著 變 化［18-19］。然而，目前有關Mtb-AEC-Exos 和Mtb-AEC-Exos miRNA 在AM 極化中的作用尚不明確。研究顯示，在結核病患者血清和Mtb 感染后人類巨噬細胞中miR-145 表達水平下調，且其表達水平與炎性細胞因子表達水平呈負相關；Mtb 感染后巨噬細胞中miR-145的過表達可抑制感染誘導的炎癥反應［20-21］。本研究結果亦顯示，Mtb感染AECⅡ來源的Exos 中，其miR-145的表達水平與正常AECⅡ來源的Exos 相比存在差異，表明Mtb-AEC-Exos 的作用可能是通過miR-145 介導的，提示Mtb-AECExos對AM極化的影響可能與miR-145有關。

為了進一步闡述miR-145 在AM 響應Mtb 感染中的作用，本研究采用慢病毒載體轉染AECⅡ以上調或抑制Exos 中miR-145 表達。CD86 和CD163 分別是M1 巨噬細胞和M2 巨噬細胞的標志物，TNF-α和iNOS是M1極化巨噬細胞的代表性指標，Arg-1和IL-10 是M2 極化巨噬細胞的代表性指標。結果顯示，上調miR-145 后，Mtb-AECⅡExos 和巨噬細胞中miR-145水平均升高，同時CD163陽性細胞、Arg-1和IL-10的mRNA 表達升高，CD86陽性細胞、iNOS和TNF-α的mRNA 表達降低，而下調miR-145 表現出相反的作用，表明Mtb-AECⅡExos中miR-145的高表達促進了M2 巨噬細胞極化，限制了M1 巨噬細胞極化，提示Mtb 刺激AECⅡ衍生的Exos 可能通過miR-145 促進巨噬細胞M2 極化并抑制M1 極化而實現。

綜上所述，Mtb 感染AECⅡ來源Exos 可能通過miR-145刺激巨噬細胞向M2型極化，對抗炎癥。本研究表明Mtb感染AECⅡ來源Exos中的miR-145介導了AEC 和巨噬細胞之間的作用，但具體的調控機制仍有待進一步明確。