環狀RNA在糖尿病腎病中的研究進展

姜赫，劉武，呂純懿，張詔△

糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）是常見的糖尿病并發癥之一，也是導致終末期腎病的主要原因［1］。DKD病理機制復雜，涉及代謝紊亂、線粒體氧化應激與血流動力學紊亂等［2］。現有治療在一定程度上只能減緩而不能阻止或逆轉DKD 的進展［3-4］。因此，進一步研究影響DKD 進展的病理機制，以鑒定新的分子標志物及開發新的治療策略至關重要。隨著分子生物學及測序技術的發展，越來越多的環狀RNA（circular RNA，CircRNA）被發現，其功能也被廣泛研究。CircRNA反向剪接的共價閉環結構，對外源核酸酶具有天然的抗性，與線性結構相比更穩定，也為CircRNA 作為生物標志物和調控因子奠定了基礎。近年來，大量研究表明CircRNA與某些腎臟疾病的發病機制有關［5-6］。本文旨在歸納與總結CircRNA 在DKD 腎臟細胞損傷中的作用，以期為前臨床提供新的思路。

1 CircRNA的結構與功能

1.1 CircRNA 的合成及生物學特征 CircRNA 是由前 體 信 使RNA（precursor messenger RNA，premRNA）后向剪接，通過5'-帽結構和3'-聚A 尾的共價鍵結合形成的閉環結構。CircRNA通過內含子配對驅動、RNA 結合蛋白驅動和套索驅動實現其環化機制的形成［7］。根據其序列，可將CircRNA 分為4類：外顯子CircRNA（EcircRNA）、環內含子RNA（CiRNA）、外顯子-內含子RNA（EIciRNA）和tRNA內含子CircRNA（TricRNA）［8］。CircRNA在不同組織與條件下表達模式不同，其在大腦和腎臟中含量豐富，在病理狀態下會異常表達，并且可在血液、尿液、唾液以及外泌體中檢測到［9-10］，因而具有作為生物標志物的潛力。

1.2 CircRNA功能

1.2.1 CircRNA作為miRNA的海綿 目前研究最廣泛的CircRNA 的生物學功能是作為miRNA 的海綿，即CircRNA 與miRNA 反 應元件（miRNA response elements，MRE）結合，通過隔離miRNA 發揮競爭性結合RNA（competing endogenous RNA，CeRNA）的作用［11］，從而調節下游mRNA的表達。

1.2.2 與RNA 結 合 蛋 白（RNA-binding proteins，RBPs）結合 CircRNA 可與多個RBPs 相互作用，從而影響它們的作用模式，調節生物功能。RBP 基因也可以轉錄成許多含有相應RBP 結合位點的CircRNA，如RNA 聚合酶Ⅱ（RNA Polymerase Ⅱ，PolⅡ）可以與CircRNA 結合，影響CircRNA 的剪接、折疊、穩定、加工和定位［12］。RBPs quking-5（QKI-5）通過與CircRNA 相互作用，促進上皮-間充質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）過 程 中CircRNA的生物發生［5］。

1.2.3 參與轉錄調控與翻譯 定位于細胞核的CircRNA 通過與PolⅡ或剪接因子U1 SnRNP（U1 small nuclear ribonucleoprotein，U1 SnRNP）相互作用，激活其親本基因的轉錄［13-14］。作為非編碼RNA，CircRNA 能否被翻譯尚存有爭議。傳統觀點認為，由于缺失5'7-甲基鳥苷（M7G）帽和3'聚A 尾，CircRNA 是不能被翻譯的。然而最近研究表明，一些CircRNA，如CircMb1、CircFBXW7、CircPINTexon2和Circ-SHPRH 等可以被翻譯成蛋白質或多肽［15］。但這些CircRNA 翻譯的詳細機制及大多數CircRNA衍生肽的功能仍然未知。

2 CircRNA在DKD腎臟細胞中的作用

DKD 的特征性臨床表現是持續、緩慢發展的蛋白尿，其損害可能累及腎臟所有組織，最終導致小動脈壁的透明改變［16-17］。早期可出現系膜細胞異常增殖、基底膜增厚、系膜基質增寬、腎小球硬化和足細胞丟失。盡管腎小管基底膜增厚，但晚期可出現腎小管萎縮、細胞凋亡增加、間質性炎性浸潤、間質纖維化和管周毛細血管稀疏［18］。DKD 的病理過程涉及多種分子途徑，越來越多的證據表明CircRNA 異常表達在DKD 中發揮作用［6］。有研究表明，腎小管間質細胞、腎小球系膜細胞、足細胞功能障礙與DKD進展密切相關［19］。本文從腎臟細胞的角度，歸納與總結DKD中CircRNA的作用。

2.1 在腎小球系膜細胞損傷中的作用 腎小球系膜細胞（mesanial cells，MCs）是腎小球的重要構成成分，在生理功能和腎臟疾病的發生發展中發揮重要作用。MCs能夠保持腎小球毛細血管的結構類似于微血管周細胞的功能。同時，MCs 有助于系膜基質的動態平衡，調節濾過表面積，吞噬凋亡細胞。系膜細胞肥大、增殖和纖維化已被認為是細胞損傷的常見生物學反應。由于腎小球系膜細胞異常發育與DKD的病理變化密切相關［20］，腎小球MCs被廣泛應用于體外DKD研究。

目前，有關CircRNA 在MCs 中的研究主要集中在細胞異常增殖、細胞外基質積聚以及纖維化方面。纖維連接蛋白（fibronectin，FN）、Ⅰ型膠原（collagenⅠ，COLⅠ）、COLⅣ等纖維蛋白增加是細胞外基質（extracellular matrix，ECM）堆積和系膜細胞增殖以及纖維化的病理基礎［21-23］。Liu 等［24］研究發現，CircHIPK3 在DKD 患者以及高糖誘導的MCs 中上調，沉默CircHIPK3 后，轉化生長因子β1（transforming growth factor beta-1，TGF-β1）、COLⅠ、COLⅣ、FN 的mRNA 表達水平降低，細胞周期蛋白D1、增殖細胞核抗原的mRNA 豐度明顯下降，沉默miR-185 可逆轉這一效果。 這些結果表明CircHIPK3 通過調節MCs 細胞周期與纖維蛋白沉積調控DKD 進展。Bai 等［25］發現高糖培養的MCs、DKD 患者和DKD 大 鼠模型中Circ_DLGAP4 表達增加，exo-Circ_DLGAP4_通過吸附miR-143 來調節受體酪氨酸蛋白激酶/核因子-κB/基質金屬蛋白酶2（ERBB3/NF-κB/MMP2）軸，進而促進系膜細胞增殖和纖維化，導致腎小球濾過屏障受損；進一步體內實驗表明，Circ_DLGAP4 過表達后通過調節miR143/ERBB3/NF-κB/MMP2 通路促進DKD 的進展。Liu等［26］研究發現，Circ_0080425（Circ_WBSCR17）與miR-24-3p的競爭性結合釋放了抑制miR-24-3p的成纖維生長因子11（fibroblast growth factor11，FGF11），從而導致DKD進展過程中細胞增殖和纖維化水平升高。Wang 等［27］研究發現，Circ_LARP4 在DKD細胞模型中下調，隨后將Circ_LARP4質粒轉染系膜細胞后，發現過表達的Circ_LARP4抑制系膜細胞增殖并增加凋亡率，降低系膜細胞纖維化相關蛋白表達，該過程通過競爭性結合miR-424 實現。因此，可以將Circ_LARP4/miR-424細胞信號軸作為體外調控DKD發生發展的候選靶點。

此外，CircRNA 參與氧化應激與炎癥反應調控系膜細胞損傷。Chen等［28］研究發現，CircLRP6通過與miR-205 競爭性調節高遷移率蛋白B1（high mobility group protein-B1，HMGB1），激活下游TLR4/NF-κB 通路，從而升高活性氧（reactive oxygen species，ROS）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，降低超氧化物歧化酶（serum superoxide dismutase，SOD）活性，并增加基質蛋白FN、COLⅠ、COLⅣ與炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α 表達，提示CircLRP6 通過調節MCs 細胞增殖、氧化應激、細胞外基質積聚與炎癥反應參與DKD 中MCs 損傷。活性氧的過量產生是DKD 代謝紊亂與腎臟血流動力學紊亂的共同特征［29］，過量活性氧會引發腎臟纖維化與炎癥，并通過促脂質氧化、DNA 損傷、蛋白修飾及線粒體功能障礙，導致組織損傷。

2.2 在腎小管上皮細胞損傷中的作用 DKD 的進展伴隨著腎小管損害，腎小管上皮細胞損傷參與了DKD 的發生，并且在DKD 患者和DKD 動物模型中均發現腎小管上皮細胞的炎癥反應和細胞凋亡。Li等［30］研究發現，Circ_WBSCR17 在DKD 小鼠模型和HK-2 細胞模型中的表達顯著上調，Circ_WBSCR17通過競爭性結合miR-185-5p 激活轉錄因子SOX6，SOX6的過表達促進細胞炎性因子的釋放，抑制細胞活力，誘導細胞凋亡，促進腎間質纖維化。Wen等［31］研究發現CircACTR2 在高糖誘導的HK-2 細胞中上調，抑制CircACTR2 顯著減少嗜酸細胞，并抑制IL-1β、COLⅠ、COLⅣ、FN 等向培養基中的釋放，提示在高糖環境下，CircACTR2 可調節高糖誘導的近端腎小管細胞焦亡、炎癥和纖維化。Zhuang 等［32］研究表明，CircHIPK3 在高糖誘導的HK-2 細胞中下調，將CircHIPK3高表達質粒轉染HK-2細胞，結果發現CircHIPK3 過表達上調Bcl-2 的表達，而下調了caspase3 和Bax 的表達。其證實了CircHIPK3 過表達通過促進HK-2細胞增殖和抑制細胞凋亡來減輕高糖誘導的細胞損傷。

2.3 在足細胞損傷中的作用 足細胞是終末分化的上皮細胞，損傷后不易增殖和再生，作為腎小球濾過膜的組成部分，足細胞結構完整與數量穩定是維持腎小球濾過率的基礎。足細胞損傷是DKD 細胞損傷中的關鍵環節［33］，CircRNA 作為miRNA 的海綿與miRNA通過抗氧化、抗炎等途徑共同調節DKD足細胞凋亡和損傷。Yao等［34］研究發現，Circ_0000285在DKD 足細胞中表達上調，將CIRC_0000285 過表達質粒轉染小鼠足細胞，發現足細胞周期被阻滯在G1 期，細胞增殖受到抑制，凋亡增加，并且Circ_0000285 充當miR-654-3p 的海綿激活絲裂原活化蛋 白 激 酶6（mitogen-activated protein kinase 6，MAPK6），調節炎性因子釋放，導致足細胞損傷。

另外，高糖環境促進快速氧化應激，是足細胞減少的主要原因［35］。活性氧的過量產生與抗氧化劑谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的還原共同導致細胞線粒體損傷［36］。而GPX4作為調節維持組織內環境平衡的關鍵酶，其表達降低會導致膜脂過氧化產物積聚［37］，從而導致鐵依賴性非凋亡性細胞死亡，即鐵死亡［38］。有研究表明，CircRNA 以鐵依賴的方式發揮作用［39］。Jin 等［40］研究發現MMU_CircRNA_0000309在DKD小鼠足細胞中下調，并通過激活miR-188-3p/GPX4 途徑調節線粒體損傷以及鐵死亡，從而導致足細胞損傷。但由于目前CircRNA 在DKD 足細胞中的研究較少，證據尚不充分，因此繼續明確CircRNA 在足細胞損傷中的分子機制，仍是后續待探討的問題。

3 CircRNA在DKD中的研究前景

氧化應激、細胞凋亡、炎癥反應、纖維化等腎臟細胞損傷被認為是DKD 發病的相關因素［2］，因此探索抑制細胞損傷的有效藥物可以協助治療。目前，CircRNA已被證實是前列腺癌、非小細胞肺癌、阿爾茨海默病以及急性心肌梗死等疾病的候選生物標志物［41-43］，而且在DKD 動物模型中也展現出基因治療的潛力。Peng 等［44］利用超聲-微泡介導的Circ_010383表達質粒導入DKD模型小鼠腎臟中，發現可以延緩腎小球硬化與腎小管間質纖維化，恢復腎功能。

雖然許多CircRNA 已經在腎臟組織中被證實，但其在DKD 發展過程中的表達譜和潛在作用，如何對其調控，與特定蛋白以及其他非編碼RNA的相互作用機制尚不清楚。因此，進一步深入了解CircRNA在DKD發病機制中的分子功能有助于更好地理解腎臟的病理生理。研究這些分子在細胞和動物模型中的潛在功能，進一步探討CircRNA 在腎臟疾病中的預測作用，仍是后續研究應努力的方向。

4 小結

腎小球細胞與腎小管細胞具有不同的病理生理功能，但其相互作用，共同調控DKD 的進展。CircRNA可能是DKD發病機制中的關鍵調節因子以及治療的有效途徑。目前的證據主要來自腎小球系膜細胞與腎小管上皮細胞，CircRNA 在其他腎臟細胞中的功能有待進一步研究。隨著基因芯片和高通量測序等技術的發展與應用，CircRNA 在DKD 中發揮的作用會逐步被闡明，有助于進一步深入了解CircRNA 在DKD 發病機制中的分子功能，更好地理解腎臟的病理生理機制，并研究這些分子在細胞和動物模型中的潛在治療能力，為以后科研成果轉化奠定基礎。