骨橋蛋白在不同病理分期原發性膽汁性膽管炎的表達特點分析

王彥坤 馬俊驥

原發性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis, PBC)是一種慢性膽汁淤積性肝病，其病因尚不清楚，以免疫介導的膽道損傷和慢性膽汁淤積為特征[1]。肝臟組織標本中出現肝內膽管損傷及纖維化等改變是PBC病理分期的重要依據，據此可以將PBC分為4期[2]。由PBC引起的肝硬化在肝組織病理分期中為第4期，此時可能會伴有多種并發癥，終末期甚至需要肝移植治療。

骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是一種糖蛋白，又稱為分泌型磷蛋白1(secreted phosphoprotein 1，SPP1)，由人類SPP1基因編碼。SPP1基因位于染色體4的4q13.22位點，經過轉錄后OPN被選擇性剪接，可以形成OPN-a、OPN-b、OPN-c、OPN-4和OPN-5五種異構體，其中OPN-a被認為是典型的轉錄本[3-5]。Fam20C介導的骨橋蛋白磷酸化是骨橋蛋白分泌的關鍵，肝硬化患者肝硬度與血清OPN表達密切相關[6-7]。研究顯示肝臟炎癥可以通過OPN促成巨噬細胞活化，OPN參與了內源性調控肝臟攝取過多的脂質以保護肝臟免受脂質毒性、細胞凋亡及相關的肝纖維化發生，從而保證肝細胞的存活，但也可能會導致分化型肝癌[8-9]。在PBC引起的肝硬化肝組織中檢測發現，OPN在肉芽腫和損傷的膽管周圍單核細胞胞質為強表達[10]。本研究通過免疫組織化學方法檢測不同PBC病理分期肝組織OPN的表達情況，探討OPN在PBC疾病進展過程中的作用。

資料與方法

一、研究對象

收集2013年12月至2020年1月首都醫科大學附屬北京佑安醫院70例PBC患者的病理資料。PBC診斷需滿足以下條件中的至少2條：①ALP>150 U/L；②抗線粒體抗體(anti-mitochondrial antibody, AMA )陽性，或其他 PBC特異性自身抗體如抗gP210抗體、抗spl00抗體中任意一項呈陽性(血清AMA陰性時)；③肝組織病理檢查提示非化膿性膽管炎和小葉間膽管破壞[2]。患者肝組織病理檢查均簽署知情同意書，研究符合倫理要求。

二、方法

評估PBC肝臟不同病理分期組織病變和纖維化選用HE、Masson和Gomori銀染方法。CK19、CK7和OPN抗體用來研究PBC肝組織膽管損傷情況和OPN表達特點，免疫組織化學染色步驟參照文獻[11-13]。OPN抗體購自abcam公司，CK7和CK19免疫組織化學染色抗體購自北京金橋雅圖生物技術有限公司，OPN、CK7和CK19陽性部位均位于細胞質。根據OPN陽性細胞數百分比和細胞平均染色強度進行綜合評分[14]。陽性細胞比例得分：0=無，1=<1%，2=1%～1/10，3=1/10至1/3，4=1/3～2/3，5=>2/3。陽性細胞平均染色強度得分：0=無，1=弱，2=中，3=強。綜合評分計算分析后1～3分的OPN被認為是低表達，4～6分的OPN被認為是中度表達，7～8分的OPN被認為是高表達。

三、 統計學處理

結 果

一、一般資料

70例患者血清AMA均陽性，其中男性10例，年齡為(53±9)歲，女性60例，年齡為(51±11)歲，男性和女性患者年齡差異無統計學意義(P=0.594)。

PBC病理1期患者18例，男性4例，女性14例，年齡(48±12)歲；2期17例，男性3例，女性14例，年齡(48±12)歲；3期18例，男性2例，女性16例，年齡(53±9)歲；4期17例，男性1例，女性16例，年齡(56±7)歲，與1期PBC患者年齡相比，年齡較大，差異有統計學意義(P=0.026)。

二、隨著PBC病程進展，肝纖維化和膽管損傷逐漸加重

肝臟穿刺病理標本是進行PBC病理分期的重要依據。通過HE、Masson和Gomori銀染方法可以初步判斷匯管區和肝小葉損傷情況，并評估肝纖維化進展程度(圖1)。PBC病理1期可以看到匯管區炎癥，部分可見匯管區肉芽腫，肝小葉基本完整、無明顯纖維化形成。隨著PBC病程進展，病理分期會逐步增加。在病理2期可以看到匯管區局灶性界板炎以及纖維化組織深入肝實質。在病理3期可以看到明顯的肝纖維化和肝臟膽汁淤積。到第4期可以看到明顯的肝硬化病理改變，以及毛細膽管膽栓形成。

圖1 采用HE、Masson和Gomori銀染方法判斷匯管區和肝小葉損傷情況，并評估肝纖維化進展程度(200×)

非化膿性膽管炎和小葉間膽管破壞是PBC典型的病理改變。本研究采用CK7和CK19抗體進行肝組織免疫組織化學染色結合評估導管反應(DR)和具有膽管化生傾向的中間肝細胞，以幫助判斷不同PBC病理分期膽管損傷、肝組織膽汁淤積情況(圖2)。在PBC病理1期肝組織切片匯管區看到受損的膽管，周圍可見炎癥細胞浸潤，膽汁淤積相對較輕。在病理2期可以看到匯管區大量的膽管反應性增生的情況發生，周圍新生肝細胞。病理3期匯管區膽管消失情況很常見。在第4期肝硬化階段，匯管區膽管缺少情況更加嚴重，周圍大量新生CK7陽性的肝細胞，同樣提示膽汁淤積很嚴重。

圖2 肝穿刺組織CK7和CK19免疫組織化學染色結果(400×)

三、在PBC病程進展后OPN表達增多，在不同病理分期存在不一樣的分布特點

免疫組織化學分析發現，OPN在男性患者中的強表達比率為20.00%，而在女性患者中OPN的強表達比率為41.67%，差異無統計學意義(χ2=0.907,P=0.341)，見表1。

表1 肝組織OPN表達評分在PBC患者中的性別差異

在1期PBC和2期PBC肝組織，OPN以中度表達為主，分別為72.22%和76.47%，也存在一部分低表達病例(分別為11.11%和5.88%)。PBC 1至3期OPN免疫組化評分強表達的比率分別為11.11%、17.65%和83.33%；1期和2期比較差異無統計學意義(χ2=0.005,P=0.945)，3期比1期明顯增加(χ2=12.586,P<0.01)，3期比2期也明顯增加(χ2=21.394,P<0.01)。OPN在4期PBC中的強表達比率為41.18%，中度表達比率為58.82%。OPN在4期PBC中的強表達與1期(χ2=0.907,P=0.341)和2期(χ2=0.907,P=0.341)相比差異無統計學意義，與3期相比則明顯下降(χ2=4.972,P=0.026)。見表2。

表2 肝組織OPN表達評分在PBC不同病理分期中的表達分布情況

OPN陽性細胞在1期PBC匯管區偶爾可以看到。與1期PBC不同，在PBC第2期至第4期肝組織匯管區中的OPN陽性細胞數均明顯增多(圖3)。

圖3 不同病理分期肝組織OPN免疫組織化學染色結果(400X)

采用非參數Spearman相關分析發現，PBC病理分期與OPN病理評分具有一定的相關性(r=0.396,P=0.001)。

討 論

PBC是導致肝硬化的一個重要病因，早期以小膽管內皮細胞損傷為主要特征，通過生物化學指標ALP和AMA抗體等可以做出臨床診斷，肝活組織檢查對于PBC治療應答和預后都有重要指導價值[2, 11]。OPN在肝硬化發病過程中具有重要作用[3-4]，但是OPN在PBC不同病理分期中的表達情況未見詳細闡述。因此，本研究重點探討了OPN在肝組織的表達情況與PBC病理分期之間的關系。

美國的研究資料顯示，每百萬人口就有293例PBC患者，其中女性PBC患者為每百萬人口428例，男性為每百萬人口107例，女性和男性比例為4∶1[2, 15]。歐洲的流行病學分析發現，每百萬人口就有222.7例PBC患者，其中女性患者為每百萬人口380.7例，男性患者為每百萬人口76.6例，女性和男性比例為5∶1[16]。本研究中PBC女性患者比例很高，OPN強表達在女性患者的比率為42%，而男性患者OPN強表達比率為20%，這可能與女性患者在病理分期3和4期中所占比重較大有關。

OPN作為細胞連接蛋白，在正常肝臟細胞、肝星狀細胞和巨噬細胞常規低表達[3, 10]。本研究中在1期PBC病理分期中3例患者肝組織OPN呈低表達狀態，2期中有1例患者肝組織OPN呈低表達狀態，但是在PBC病理分期3期和4期患者，肝組織中未見OPN低表達狀態。對肝組織OPN高表達病例進行分析發現，隨著病理分期從1期進展至3期的過程中，OPN高表達比例逐漸增高，提示OPN高表達與PBC進展過程密切相關。PBC病理分期第3期也稱為肝纖維化期，OPN高表達比例在第3期最高，說明OPN可能與肝組織纖維化相關。盡管在第4期無OPN低表達狀態患者，但是OPN高表達比例與第3期相比較低，這可能與肝硬化期PBC肝組織再生能力下降有關系。

本研究采用CK7和CK19來標記膽管細胞，可以區分正常膽管結構、肝組織再生過程中反應性增生的膽管細胞和具有雙向分化潛能的部分肝細胞[11-12]。PBC病理1期匯管區膽管消失很少見，常見的是膽管細胞損傷，并伴隨周圍炎細胞浸潤形成肉芽腫，因此在PBC病理1期肝組織偶爾可以OPN陽性表達的巨噬細胞，而在匯管區周圍肝細胞表達以低表達或者中度表達為主。PBC病理2期匯管區導管反應常見，損傷的膽管細胞周圍明顯肉芽腫，常伴隨界面性肝炎，CK7陽性肝細胞增多，在PBC病理2期擴大的匯管區常可以看到OPN陽性表達的巨噬細胞。PBC病理3期匯管區膽管缺失常見，膽汁淤積加重，Masson染色和Gomori銀染可以看到來自匯管區大量纖維組織延伸至肝小葉內，匯管區內可見大量OPN陽性表達的巨噬細胞和淋巴細胞，匯管區周圍肝細胞OPN通常高表達。在PBC病理4期成纖維細胞明顯增多，形成巨大的纖維瘢痕分割肝組織，形成假小葉，OPN陽性表達的巨噬細胞和淋巴細胞所占比率與第3期相比有所下降，毛細膽管中可見膽栓形成。通過OPN在PBC病理4個分期匯管區的表達分布特點分析可以發現，OPN高表達與引起膽管細胞免疫損傷的炎癥細胞有關，同時也與肝組織損傷修復過程中的再生肝細胞有關。

綜上所述，PBC發展到肝纖維化后，OPN在肝組織中的表達量明顯增加，肝硬化后OPN高表達比率降低。OPN高表達提示膽管免疫損傷負荷加重，同時也預示肝組織增生能力較強。OPN與PBC病理分期密切結合對于病情嚴重程度評估及患者預后預測有重要的臨床價值。