馬錢苷聯合miR-3619-5p靶向遷移侵襲增強因子1對宮頸癌SiHa細胞遷移和凋亡的影響

馮雙苗，張化蓮，袁有華

馬錢苷聯合靶向遷移侵襲增強因子1對宮頸癌SiHa細胞遷移和凋亡的影響

馮雙苗1，張化蓮1，袁有華2*

1. 駐馬店市中心醫院 產科，河南 駐馬店 463000 2. 河南省人民醫院 檢驗科，河南 鄭州 450000

研究馬錢苷聯合靶向遷移侵襲增強因子1（migration and invasion enhancer 1，MIEN1）對宮頸癌SiHa細胞遷移和凋亡的影響。采用qRT-PCR法檢測宮頸癌SiHa、Hela、CasKi細胞和正常宮頸上皮Ect1/E6E7細胞中mRNA表達。在宮頸癌SiHa細胞中轉染mimics上調的表達，給予馬錢苷處理，采用CCK-8法分析細胞增殖；流式細胞術分析細胞凋亡；Transwell小室分析細胞遷移和侵襲能力的變化；Western blotting法分析剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved cystein-asparate protease-3，cleaved Caspase-3）和基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloprotease-2，MMP-2）蛋白表達。生物信息學軟件預測的靶基因，利用熒光素酶報告系統鑒定二者的靶向關系。在宮頸癌SiHa細胞中共轉染mimics和MIEN1過表達載體，考察細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的變化。宮頸癌SiHa、Hela、CasKi細胞中mRNA表達水平低于正常宮頸上皮Ect1/E6E7細胞（＜0.05），并且宮頸癌SiHa細胞中表達水平最低。上調、馬錢苷處理或二者聯合處理后的宮頸癌SiHa細胞增殖、遷移和侵襲能力均下降（＜0.05），細胞凋亡升高（＜0.05），細胞cleaved Caspase-3蛋白表達水平升高（＜0.05），MMP-2蛋白表達水平降低（＜0.05），并且二者聯合處理后對細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的作用更強。靶向促進MIEN1表達。MIEN1過表達載體逆轉馬錢苷聯合對宮頸癌SiHa細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的作用（＜0.05）。馬錢苷聯合靶向MIEN1能夠抑制宮頸癌SiHa細胞增殖、遷移、侵襲能力，并促進細胞凋亡。

馬錢苷；宮頸癌；miR-3619-5p；遷移侵襲增強因子1；凋亡；侵襲

宮頸癌是引起女性死亡的主要惡性腫瘤之一，是目前世界范圍內的第4大癌癥，嚴重威脅著廣大女性的生命健康[1-2]。中藥以及靶向基因治療在腫瘤中的研究最為廣泛，二者有不良反應小、安全性高等特點，可能是未來腫瘤治療的重要途徑。

馬錢苷是從山茱萸Sieb. et Zucc.中提取出的一種環烯醚萜類化合物，具有營養神經、免疫調節、改善氧化應激等作用[3]。研究發現，馬錢苷能夠誘導腫瘤細胞凋亡并抑制其轉移，馬錢苷處理后的肝癌細胞凋亡水平增加，胃癌細胞轉移能力降低[4-5]。

miRNA是非編碼RNA，在很多生理以及病理過程中均有調節作用，與胚胎發育、細胞生長、細胞運動等有關[6]。研究顯示，miRNA和腫瘤的關系十分密切，miRNA是未來腫瘤治療的分子靶點[7]。是一個在前列腺癌、甲狀腺癌等腫瘤中表達下調的調控因子，在腫瘤進展中發揮抑制作用[8-9]。目前馬錢苷聯合對宮頸癌細胞生物學行為的影響尚不清楚。本研究以宮頸癌SiHa細胞為研究對象，探討馬錢苷聯合在體外宮頸癌細胞惡性表型中的功能，為馬錢苷聯合治療宮頸癌提供理論基礎。

1 材料

1.1 細胞

正常宮頸上皮Ect1/E6E7細胞（批號QCB1077）購自上海欽誠生物科技有限公司；宮頸癌SiHa（批號CL-0210）、HeLa（批號CL-0101）、CasKi（批號CL-0048）細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

mirVanan miRNA試劑盒（批號638369）、mir-X miRNA qRT-PCR SYBR試劑盒（批號638314）購自美國Clontech公司；剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved cystein-asparate protease-3，cleaved Caspase-3）抗體（批號ab179517）購自美國Abcam公司；mimics、mimics control、遷移侵襲增強因子1（migration and invasion enhancer 1，MIEN1）過表達載體（pcDNA3.1-MIEN1）、陰性對照載體（pcDNA3.1）均由北京安必奇生物科技有限公司構建合成；基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloprotease-2，MMP-2）抗體（批號ml085664）、MIEN1抗體（批號ml091507）購自上海酶聯生物科技有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、羊抗兔二抗購自北京中杉金橋公司；馬錢苷（批號BP0884，質量分數＞98%）購自成都普瑞法科技開發有限公司。

1.3 儀器

熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；Varioskan LUX酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；C6型流式細胞儀（美國BD公司）；微管離心機（美國Axygen公司）；1-14K型低溫離心機（美國Sigma公司）；垂直電泳槽、電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 qRT-PCR分析宮頸癌細胞miR-3619-5p表達

分別收集處于對數生長期的宮頸癌SiHa、HeLa、CasKi細胞和正常宮頸上皮Ect1/E6E7細胞，按照試劑盒說明書提取細胞中總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。將作為的內參。引物序列：上游引物5’-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3’，下游引物5’-GCCATCACGCCACAGTTTC-3’；上游引物5’-TTGAGGCTCTGCAGCTTAG-3’，下游引物5’-CTGTGGTGGTTTACAAAGTAATT-3’。

2.2 CCK-8檢測馬錢苷對宮頸癌細胞增殖的影響

將宮頸癌SiHa細胞以3000個/孔接種到96孔板內，于37 ℃、5% CO2培養箱內培養過夜，吸去培養基，分別加入含有馬錢苷最終質量濃度為10、25、50、100、200 μg/mL的培養基，對照組加入不含藥物的培養基，培養24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，于振蕩儀充分混合1 min，37 ℃繼續孵育3 h。采用酶標儀測定每孔在490 nm處的吸光度（）值，計算細胞存活率。

細胞存活率＝實驗/對照

2.3 實驗分組

宮頸癌SiHa細胞分成對照組、馬錢苷＋miR-NC組、miR-NC組、組和馬錢苷＋組，馬錢苷＋miR-NC組和miR-NC組均為轉染mimics control后的細胞，組和馬錢苷＋組均為轉染mimics后的細胞，馬錢苷＋miR-NC組和馬錢苷＋組細胞在實驗開始時加入最終質量濃度為100 μg/mL的馬錢苷處理，對照組細胞不進行處理。

按“2.1”項下方法檢測對照組、miR-NC組和組細胞mRNA表達。

2.4 CCK-8檢測馬錢苷聯合miR-3619-5p對宮頸癌細胞增殖的影響

對照組、馬錢苷＋miR-NC組、miR-NC組、組和馬錢苷＋miR-3619-5p組細胞培養24 h后，按照“2.2”項下方法檢測細胞存活率。

2.5 流式細胞術分析馬錢苷聯合miR-3619-5p對宮頸癌細胞凋亡的影響

對照組、馬錢苷＋miR-NC組、miR-NC組、組和馬錢苷＋miR-3619-5p組細胞培養24 h后，棄去上清液，以PBS溶液洗滌，加入0.25%胰蛋白酶消化后，離心，收集細胞沉淀。以PBS溶液將細胞潤洗3次，加入500 μL的Binding Buffer溶液（細胞密度為1×106個/mL），加入5 μL Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min；加入5 μL碘化丙啶（PI），室溫避光孵育10 min，立即采用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況。

2.6 Transwell小室分析馬錢苷聯合miR-3619-5p對宮頸癌細胞遷移和侵襲的影響

2.6.1 遷移實驗 對照組、馬錢苷＋miR-NC組、miR-NC組、組和馬錢苷＋組細胞分別用無血清的細胞培養基懸浮（細胞密度為1×106個/mL），吸取200 μL各組細胞加入到Transwell小室的上室中，同時吸取500 μL含血清的細胞培養基加入到小室的下室內，于37 ℃的CO2培養箱中培養24 h。取出小室，用棉簽小心地把上室底膜中的細胞擦除，以4%多聚甲醛固定上室底膜內的細胞，用0.1%結晶紫染色，加入PBS溶液洗滌2次。將小室放在顯微鏡下并隨機選擇5個視野，分別計數穿膜的細胞數量，計算平均值，為細胞遷移數目。

2.6.2 侵襲實驗 按1∶9比例將基質膠和D-hanks液混合，吸取20 μL上述溶液加入到Transwell小室的上室內，于37 ℃培養箱中孵育4 h，待基質膠凝固后，吸除殘留的液體。按“2.6.1”項下方法處理并計算細胞侵襲數目。

2.7 Western blotting檢測馬錢苷聯合miR-3619-5p對宮頸癌細胞cleaved Caspase-3和MMP-2蛋白表達的影響

對照組、馬錢苷＋miR-NC組、miR-NC組、組和馬錢苷＋組細胞培養24 h后，棄去上清液，加入RIPA裂解液，于冰上裂解20 min，4 ℃、12 000×離心10 min，吸取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度。蛋白樣品經12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入5%牛血清白蛋白溶液，室溫封閉2 h。分別加入相應抗體，4 ℃孵育過夜；加入二抗，室溫孵育2 h。加入ECL發光液顯影，采用Image J軟件分析條帶灰度值。

2.8 miR-3619-5p與MIEN1靶向關系預測和鑒定

利用生物信息學軟件Targetscan分析可能的靶基因，根據熒光素酶報告系統對靶向關系進行鑒定。將含有MIEN1的3’-UTR端結合位點的WT熒光素酶報告載體和含有突變后的MIEN1的3’-UTR端結合位點的MUT熒光素酶報告載體分別和mimics、mimics control共轉染到宮頸癌SiHa細胞中，培養24 h后，利用熒光素酶活性測定試劑盒對細胞熒光素酶活性進行檢測分析。WT和MUT均由武漢巴菲爾生物技術服務有限公司構建。收集對照組、miR-NC組、miR-3619-5p組細胞，利用Western blotting法檢測細胞MIEN1蛋白表達。

2.9 MIEN1過表達載體的逆轉作用檢測

宮頸癌SiHa細胞分別共轉染mimics與陰性對照載體、mimics與MIEN1過表達載體，然后用含有100 μg/mL的馬錢苷處理24 h，記為馬錢苷＋＋Vector組和馬錢苷＋＋MIEN1組。按“2.4”項下方法檢測細胞存活率，按“2.5”項下方法檢測細胞凋亡槍口，按“2.6”項下方法檢測細胞的遷移和侵襲能力，按“2.7”項下方法檢測細胞cleaved Caspase-3、MMP-2和MIEN1蛋白表達情況。

2.10 統計學分析

3 結果

3.1 miR-3619-5p在宮頸癌細胞中相對低表達

如表1所示，宮頸癌SiHa、Hela、CasKi細胞mRNA表達水平明顯低于正常宮頸上皮Ect1/E6E7細胞（＜0.05），并且宮頸癌SiHa細胞中表達水平最低。

3.2 馬錢苷抑制宮頸癌SiHa細胞增殖

如表2所示，與對照組比較，馬錢苷（25、50、100、200 μg/mL）組SiHa細胞存活率顯著降低（＜0.05），100 μg/mL的馬錢苷處理后的細胞存活率接近50%，因此選擇100 μg/mL馬錢苷進行后續實驗。

3.3 miR-3619-5p mimics上調宮頸癌SiHa細胞中miR-3619-5p mRNA表達

如表3所示，組SiHa細胞mRNA表達水平顯著高于miR-NC組（＜0.05）。表明mimics上調宮頸癌SiHa細胞中mRNA表達水平。

表1 宮頸癌SiHa、Hela、CasKi細胞和正常宮頸上皮Ect1/E6E7細胞中miR-3619-5pmRNA表達(, n = 9)

Table 1 miR-3619-5p mRNA expression in cervical cancer SiHa, Hela, CasKi cells and normal cervical epithelial Ect1/E6E7 cells(, n = 9)

細胞miR-3619-5p mRNA相對表達量 Ect1/E6E71.00±0.11 SiHa0.35±0.04* Hela0.46±0.05* CasKi0.68±0.07*

與Ect1/E6E7組比較：*＜0.05

*< 0.05Ect1/E6E7 group

表2 馬錢苷對宮頸癌SiHa細胞增殖的影響(, n = 9)

Table 2 Effect of loganin on proliferation of cervical cancer SiHa cells(, n = 9)

組別質量濃度/(μg·mL?1)存活率/% 對照—100.00±12.02 馬錢苷1093.25±8.15 2586.32±5.16* 5075.49±6.33* 10052.01±6.14* 20040.21±4.78*

與對照組比較：*＜0.05

*< 0.05control group

表3 miR-3619-5p mimics轉染后的宮頸癌SiHa細胞中miR-3619-5pmRNA表達(, n = 9)

Table 3 miR-3619-5p mRNA expression in cervical cancer SiHa cells transfected with miR-3619-5p mimics(, n = 9)

組別miR-3619-5p mRNA相對表達量 對照1.00±0.11 miR-NC0.98±0.09 miR-3619-5p2.65±0.23*

與miR-NC組比較：*＜0.05

*< 0.05miR-NC group

3.4 馬錢苷聯合miR-3619-5p對宮頸癌SiHa細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和cleaved Caspase-3和MMP-2蛋白表達的影響

如圖1、2和表4所示，與miR-NC組比較，組、馬錢苷＋miR-NC組和馬錢苷＋組宮頸癌SiHa細胞存活率顯著降低（＜0.05），細胞凋亡率升高（＜0.05），細胞遷移和侵襲數目增多（＜0.05），cleaved Caspase-3蛋白表達水平升高（＜0.05），MMP-2蛋白表達水平下降（＜0.05）；與組和馬錢苷＋miR-NC組比較，馬錢苷＋組宮頸癌SiHa細胞存活率降低（＜0.05），細胞凋亡率升高（＜0.05），細胞遷移和侵襲數目增多（＜0.05），cleaved Caspase-3蛋白表達水平升高（＜0.05），MMP-2蛋白表達水平下降（＜0.05）。

圖1 馬錢苷聯合miR-3619-5p對宮頸癌SiHa細胞凋亡 (A)、遷移及侵襲 (B) 的影響

圖2 馬錢苷聯合miR-3619-5p對宮頸癌SiHa細胞cleaved Caspase-3和MMP-2蛋白表達的影響

表4 馬錢苷聯合miR-3619-5p對宮頸癌SiHa細胞存活率、凋亡率、侵襲數目、遷移數目及cleaved Caspase-3和MMP-2蛋白表達的影響(, n = 9)

Table 4 Effect of loganin combined with miR-3619-5p on survival rate, apoptosis rate, invasion number, migration number and cleaved Caspase-3 and MMP-2 protein expressions in cervical cancer SiHa cells(, n = 9)

組別劑量/(μg·mL?1)存活率/%凋亡率/%侵襲數目遷移數目cleaved Caspase-3蛋白表達量MMP-2蛋白表達量 對照—100.00±9.964.11±0.3093.96±9.94136.84±12.450.32±0.030.90±0.10 miR-NC—99.51±9.784.26±0.4396.23±8.76134.36±12.080.31±0.040.89±0.07 miR-3619-5p—63.23±5.58*19.68±1.74*69.20±5.14*100.16±10.53*0.45±0.05*0.65±0.06* 馬錢苷＋miR-NC10053.41±5.26*21.56±2.50*60.42±4.36*90.32±8.77*0.63±0.07*0.47±0.04* 馬錢苷＋miR-3619-5p10032.05±2.95*#&29.36±2.75*#&42.74±4.45*#&63.23±5.70*#&0.88±0.08*#&0.38±0.03*#&

與miR-NC組比較：*＜0.05；與組比較：#＜0.05；與馬錢苷＋miR-NC組比較：&＜0.05

*< 0.05miR-NC group;#< 0.05group;&< 0.05loganin + miR-NC group

3.5 miR-3619-5p靶向促進MIEN1表達

生物信息學軟件分析和MIEN1的3’-UTR端結合位點見圖3；WT和mimics共轉染后的細胞熒光素酶活性降低（表5）。如圖4和表6所示，組SiHa細胞MIEN1蛋白表達水平顯著低于miR-NC組（＜0.05）。

圖3 miR-3619-5p靶向調控MIEN1

表5 各組熒光素酶活性(, n = 9)

Table 5 Luciferase activity in each group (, n = 9)

組別WTMUT miR-NC1.00±0.081.00±0.09 miR-3619-5p0.43±0.05*0.98±0.13

與miR-NC組比較：*＜0.05

*< 0.05miR-NC group

圖4 Western blotting檢測MIEN1蛋白表達

表6 miR-3619-5p mimcis轉染后的宮頸癌SiHa細胞中MIEN1蛋白表達水平(, n = 9)

Table 6 MIEN1 protein expression level in cervical cancer SiHa cells transfected with miR-3619-5p mimcis (, n = 9)

組別MIEN1蛋白相對表達量 對照0.96±0.10 miR-NC0.95±0.11 miR-3619-5p0.53±0.04*

與miR-NC組比較：*＜0.05

*< 0.05miR-NC group

3.6 上調MIEN1對馬錢苷聯合miR-3619-5p調控宮頸癌SiHa細胞細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和cleaved Caspase-3、MMP-2和MIEN1蛋白表達的影響

如圖5和表7所示，與馬錢苷＋＋Vector組比較，馬錢苷＋＋MIEN1組SiHa細胞存活率明顯升高（＜0.05），細胞凋亡率降低（＜0.05），細胞侵襲和遷移數目增加（＜0.05），細胞MMP-2、MIEN1蛋白表達水平升高（＜0.05），cleaved Caspase-3蛋白表達水平降低（＜0.05）。

圖5 MIEN1對馬錢苷聯合miR-3619-5p影響宮頸癌SiHa細胞凋亡 (A)、遷移 (B)、侵襲 (C) 及cleaved Caspase-3、MMP-2和MIEN1蛋白表達 (D) 的作用

表7 MIEN1過表達載體、mimics轉染后經馬錢苷處理的宮頸癌SiHa細胞存活率、凋亡率、侵襲數目、遷移數目及cleaved Caspase-3、MMP-2和MIEN1蛋白表達水平(,= 9)

Table 7 Survival rate, apoptosis rate, invasion number, migration number and cleaved Caspase-3, MMP-2 and MIEN1 protein expression levels in cervical cancer SiHa cells transfected with MIEN1 overexpression vector andmimics and treated with loganin(,= 9)

組別劑量/(μg·mL?1)存活率/%凋亡率/%侵襲數目遷移數目cleaved Caspase-3蛋白表達量MMP-2蛋白表達量MIEN1蛋白表達量 馬錢苷＋miR-3619-5p100100.00±10.2527.86±2.1743.65±3.2660.95±6.320.89±0.090.36±0.040.45±0.04 馬錢苷＋miR-3619-5p＋MIEN1100169.32±14.15*14.02±1.36*68.62±5.17*88.77±6.38*0.40±0.05*0.76±0.06*0.99±0.12*

與馬錢苷＋組比較：*＜0.05

*< 0.05loganin +group

4 討論

研究發現，馬錢苷對糖尿病、帕金森病等多種疾病均有改善作用[10-11]；馬錢苷能夠激活肝癌細胞中的凋亡通路[4]；馬錢苷抑制胃癌細胞轉移能力[5]；馬錢苷可以降低結腸癌細胞的增殖能力[12]。本研究結果顯示，馬錢苷能夠抑制宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移，促進細胞凋亡，提示馬錢苷具有抑制宮頸癌的作用。

細胞的遷移、侵襲以及凋亡發生是一個多基因、多步驟的復雜調控過程。腫瘤細胞遷移和侵襲過程中，需要先將細胞外基質降解[13]。MMPs是存在于人體組織中的基質降解酶，包含多個成員，能夠將細胞外基質中的不同組分降解[14]。MMP-2是MMPs成員之一，其表達改變和腫瘤的轉移能力有關，MMP-2表達水平越高，細胞轉移能力越強[15]。Caspase是細胞凋亡進展中的凋亡相關蛋白家族，其蛋白成員只有被剪切后形成活化的Caspase才能激活細胞凋亡[16]。Caspase-3是位于Caspase凋亡反應中的下游因子，在細胞凋亡中有執行作用，Caspase-3活化形成cleaved Caspase-3，從而不可逆地激活細胞凋亡[17]。結果顯示，馬錢苷上調cleaved Caspase-3蛋白表達，下調MMP-2蛋白表達，提示馬錢苷促進細胞凋亡，并抑制細胞侵襲、遷移，這與細胞凋亡、侵襲和遷移檢測結果一致。

宮頸癌的發生和其他腫瘤一樣，均受到基因的調節作用，這些基因通過復雜的網絡最終影響了腫瘤進程[18]。研究顯示，miRNA作為一種沒有開放閱讀框的小分子RNA，具有十分廣泛的作用，在細胞生長、衰老、代謝等生理進展中發揮功能[19]。miRNA在腫瘤中的作用引起人們的廣泛關注，腫瘤組織有著與正常組織不同的miRNA表達譜，差異表達的miRNA可能是腫瘤治療的靶點[20]。研究發現，在肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多種腫瘤中發揮抑制作用，其在腫瘤組織中表達下調，可能是一個腫瘤抑制因子[8,21-22]。結果顯示，在宮頸癌細胞中低表達，并且上調可以降低宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲能力，激活細胞凋亡途徑，提示在宮頸癌進展中可能發揮抑癌基因的作用。此外，本研究發現，和馬錢苷聯合處理后的宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲能力進一步被抑制，細胞凋亡水平更高，提示和馬錢苷聯合可能是未來宮頸癌治療的潛在途徑。

miRNA發揮作用和調控下游靶基因的表達有關，其能夠和靶mRNA的3’-UTR端互補結合，降低下游靶蛋白的表達[23]。miRNA能夠和多個靶基因作用，一個靶基因可以同時受到很多miRNA的靶向調節作用，因此，miRNA通過這個復雜的網絡影響生理和病理進程[24]。研究顯示，靶向促進宮頸癌細胞中MIEN1的表達。MIEN1是和腫瘤轉移有關的調節因子，已知MIEN1在宮頸癌中高表達，并且下調MIEN1抑制宮頸癌細胞惡性生物學行為[25]。本研究發現，上調MIEN1能夠逆轉馬錢苷聯合對宮頸癌細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡的作用，提示馬錢苷聯合靶向MIEN1影響宮頸癌生物學行為。

綜上，馬錢苷聯合具有抑制宮頸癌進展的作用，其可以在體外抑制宮頸癌細胞的侵襲、增殖、遷移，激活細胞凋亡途徑，作用機制與靶向調控MIEN1有關。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Saei Ghare Naz M, Kariman N, Ebadi A,. Educational interventions for cervical cancer screening behavior of women: A systematic review [J]., 2018, 19(4): 875-884.

[2] Kovachev S M. Cervical cancer and vaginal microbiota changes [J]., 2020, 202(2): 323-327.

[3] 甘嘯陽, 王威, 呂楊, 等. 馬錢苷對AGEs致巨噬細胞極化的影響 [J]. 南京中醫藥大學學報, 2020, 36(1): 46-50.

[4] 張聰, 胡娜, 李珊, 等. 馬錢苷對肝癌細胞HepG2增殖與凋亡的影響及機制研究 [J]. 中國藥房, 2020, 31(7): 782-788.

[5] 張藝, 張卓奇, 程華, 等. 馬錢苷對胃癌細胞上皮-間充質轉化的影響及其機制 [J]. 中華實驗外科雜志, 2019, 36(11): 2004-2007.

[6] Chen L, Heikkinen L, Wang C L,. Trends in the development of miRNA bioinformatics tools [J]., 2019, 20(5): 1836-1852.

[7] Shao T T, Wang G J, Chen H,. Survey of miRNA-miRNA cooperative regulation principles across cancer types [J]., 2019, 20(5): 1621-1638.

[8] Li S M, Wang C H, Yu X,. miR-3619-5p inhibits prostate cancer cell growth by activating CDKN1A expression [J]., 2017, 37(1): 241-248.

[9] Wang G, Wang X, Jin Y.//feedback loop regulates papillary thyroid carcinoma cell proliferation and apoptosis [J]., 2019, 34(9): 572-580.

[10] 趙文望, 皮文霞, 蔡寶昌, 等. 馬錢苷、莫諾苷對高糖致心肌細胞損傷的保護機制研究 [J]. 中成藥, 2016, 38(1): 160-163.

[11] 汪林芳, 黃術兵, 徐一達, 等. 馬錢苷對MPTP誘導的PC12細胞自噬的作用研究 [J]. 神經藥理學報, 2016, 6(5): 14-21.

[12] 胡小紅, 王美玲, 諶江城, 等. 馬錢苷對結腸癌SW480細胞增殖的影響及機制初探 [J]. 廣東藥學院學報, 2015, 31(1): 80-83.

[13] Ganguly S S, Hostetter G, Tang L,. Notch3 promotes prostate cancer-induced bone lesion development via MMP-3 [J]., 2020, 39(1): 204-218.

[14] Zhang S, Yang Y, Huang S,. SIRT1 inhibits gastric cancer proliferation and metastasis via STAT3/MMP-13 signaling [J]., 2019, 234(9): 15395-15406.

[15] Cowell S, Carroll L, Lavdas I,. Towards an MMP-2-activated molecular agent for cancer imaging [J]., 2018, 47(5): 1530-1534.

[16] Zhou M, Liu X, Li Z,. Caspase-3 regulates the migration, invasion and metastasis of colon cancer cells [J]., 2018, 143(4): 921-930.

[17] Bernard A, Chevrier S, Beltjens F,. Cleaved caspase-3 transcriptionally regulates angiogenesis-promoting chemotherapy resistance [J]., 2019, 79(23): 5958-5970.

[18] Laengsri V, Kerdpin U, Plabplueng C,. Cervical cancer markers: Epigenetics and microRNAs [J]., 2018, 49(2): 97-111.

[19] Tiwari A, Mukherjee B, Dixit M. MicroRNA key to angiogenesis regulation: MiRNA biology and therapy [J]., 2018, 18(3): 266-277.

[20] 蔣雪梅, 權毅. 上調miRNA-27a-3p對乳腺癌MCF-7細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響 [J]. 鄭州大學學報: 醫學版, 2019, 54(2): 279-283.

[21] Niu X C, Liu S, Jia L,. Role of MiR-3619-5p in β-catenin-mediated non-small cell lung cancer growth and invasion [J]., 2015, 37(4): 1527-1536.

[22] Zhang Q, Miao S, Han X,. MicroRNA-3619-5p suppresses bladder carcinoma progression by directly targeting β-catenin and CDK2 and activating p21 [J]., 2018, 9(10): 960.

[23] Lu T X, Rothenberg M E. MicroRNA [J]., 2018, 141(4): 1202-1207.

[24] Kappel A, Keller A. miRNA assays in the clinical laboratory: Workflow, detection technologies and automation aspects [J]., 2017, 55(5): 636-647.

[25] 姚慧欣, 王鈞峰, 吳金濤, 等. miR-136-5p靶向MIEN1對宮頸癌細胞侵襲和遷移的調節及機制研究 [J]. 西安交通大學學報: 醫學版, 2020, 41(3): 362-368.

Effect of loganin combined withtargeting MIEN1 on migration and apoptosis of cervical cancer SiHa cells

FENG Shuang-miao1, ZHANG Hua-lian1, YUAN You-hua2

1. Department of Production, Zhumadian Central Hospital, Zhumadian 463000, China 2. Department of Laboratory Medicine, Henan Provincial People’s Hospital, Zhengzhou 450000, China

To investigate the effect of loganin combined withtargeting migration and invasion enhancer 1 (MIEN1) on migration and apoptosis of cervical cancer SiHa cells.mRNA expression in cervical cancer SiHa, Hela, CasKi cells and normal cervical epithelial Ect1/E6E7 cells were detected by qRT-PCR. Cervical cancer SiHa cells were transfected withmimics to up-regulate the expression ofand treated with loganine. Cell proliferation was analyzed by CCK-8 method; Cell apoptosis was analyzed by flow cytometry; Migration and invasion abilities of cells were analyzed by Transwell chamber; Cleaved cystein-asparate protease-3 (cleaved Caspase-3) and matrix metalloprotease-2 (MMP-2) protein expressions were detected by Western blotting. Bioinformatics software was used to predict the target genes of, and luciferase reporter system was used to identify the targeting relationship between the two. Cervical cancer SiHa cells were co-transfected withmimics and MIEN1 overexpression vector to investigate the changes in cell proliferation, apoptosis, migration and invasion.mRNA expression level in cervical cancer SiHa, Hela and CasKi cells was lower than that in normal cervical epithelial Ect1/E6E7 cells (< 0.05), and miR-3619-5p expression level in cervical cancer SiHa cells was the lowest. After up-regulation of, given loganin or a combination of two treatments, cells proliferation, migration and invasion abilities were decreased (< 0.05), cell apoptosis was increased (< 0.05), cleaved Caspase-3 protein expression was increased (< 0.05), and MMP-2 protein expression was decreased (< 0.05). And combined treatment of two had a stronger effect on cells proliferation, apoptosis, invasion and migration.targeted MIEN1 expression. MIEN1 overexpression vector reversed the effects of loganin combined withon proliferation, apoptosis, migration and invasion of cervical cancer SiHa cells (< 0.05).Loganin combined withtargeting MIEN1 can inhibit the proliferation, migration and invasion of cervical cancer SiHa cells, and promote cell apoptosis.

loganin; cervical cancer; miR-3619-5p; migration and invasion enhancement factor 1; apoptosis; invasion

R285.5

A

0253 - 2670(2022)14 - 4409 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.14.020

2022-01-21

馮雙苗，碩士，副主任醫師，研究方向為婦科腫瘤。E-mail: fsmiao0607@163.com

袁有華，本科，副主任技師，研究方向為腫瘤細胞凋亡。E-mail: yuanyouhua1968@163.com

[責任編輯 李亞楠]