椿乳凝膠抗低危型人乳頭瘤病毒的作用研究

吳夢(mèng)瑤，彭冬冬，龔 云，彭 印，張 鵬，張小冬，唐小燕，張妙紅，姜德建*

椿乳凝膠抗低危型人乳頭瘤病毒的作用研究

吳夢(mèng)瑤1，彭冬冬2, 3#，龔 云1，彭 印2, 3，張 鵬1，張小冬2, 3，唐小燕2, 3，張妙紅2, 3，姜德建2, 3*

1. 株洲千金藥業(yè)股份有限公司，湖南 株洲 412000 2. 新藥藥效與安全性評(píng)價(jià)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410331 3. 湖南普瑞瑪藥物研究中心有限公司，湖南 長沙 410331

研究椿乳凝膠抗低危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的作用。建立低危型HPV6、HPV11假病毒感染人胚腎293FT細(xì)胞模型，評(píng)價(jià)椿乳凝膠對(duì)HPV感染能力及對(duì)細(xì)胞周期的影響。將HPV6、HPV11假病毒注入苯甲酸雌二醇預(yù)處理的雌性小鼠陰道內(nèi)建立HPV感染動(dòng)物模型，病毒感染48 h后檢測(cè)病毒定植情況，將定植成功的小鼠模型隨機(jī)分為模型組、鬼臼毒素（1 mg/只）和椿乳凝膠低、中、高劑量（0.01、0.02、0.04 g/只）組，另設(shè)對(duì)照組，每組16只。每天陰道給予相應(yīng)藥物1次，連續(xù)20 d，分別于給藥第10、20天檢測(cè)小鼠陰道外觀、pH值，末次給藥后觀察小鼠陰道及宮頸組織病理形態(tài)學(xué)變化，以及HPV6、HPV11假病毒的病毒滴度，、基因和蛋白表達(dá)，評(píng)價(jià)椿乳凝膠對(duì)低危型HPV病毒的體內(nèi)抑制作用。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，椿乳凝膠對(duì)HPV6、HPV11假病毒感染能力和所致細(xì)胞周期改變具有一定抑制作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，椿乳凝膠能降低HPV6、HPV11假病毒感染能力（＜0.01），降低小鼠陰道pH值（＜0.01），減輕宮頸組織病變（＜0.05、0.01），并且抑制HPV6、HPV11假病毒、基因和蛋白的表達(dá)（＜0.05、0.01）。HPV6、HPV11假病毒能較好地模擬低危型HPV病毒感染過程，而椿乳凝膠對(duì)低危型HPV病毒具有明顯的抑制作用，對(duì)低危型HPV病毒引起的感染有一定治療作用。

低危型人乳頭瘤病毒；HPV6；HPV11；假病毒；椿乳凝膠

人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是一種嗜上皮組織的無包膜雙鏈環(huán)狀DNA病毒，目前已發(fā)現(xiàn)約200種不同HPV型別[1]。根據(jù)其致病力的大小可以分為高危型HPV和低危型HPV。高危型HPV包括HPV16、18、26、31、33、35、39等，可以引起外生殖器癌、宮頸癌、高度外陰瘤變和其他部位的惡性病變等。低危型HPV主要包括HPV6、11、40、42、43、44等，主要引起肛門-外生殖器疣和皮膚疣等良性病變[2]。HPV病毒的基因組按功能可分為早期編碼區(qū)（E區(qū)）、晚期編碼區(qū)（L區(qū)）以及非編碼區(qū)。早期編碼區(qū)主要負(fù)責(zé)病毒DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控，其中E6、E7在高危型HPV導(dǎo)致癌癥中發(fā)揮重要作用。晚期編碼區(qū)參與病毒衣殼蛋白的合成，包括主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2[3-4]。

椿乳凝膠主要由椿皮、苦參、牡丹皮、乳香、冰片等中藥組方而成，為名老中醫(yī)多年的經(jīng)驗(yàn)方，并且有10多年的醫(yī)院制劑使用史。方中君藥椿皮清熱祛濕、止帶；苦參、丹皮清熱燥濕、止癢為臣藥，以增強(qiáng)君藥功效；乳香活血化瘀、生肌，冰片散熱消腫、止癢為佐藥，以助主藥祛瘀生肌。全方具有清熱燥濕、祛瘀生肌的功效，主要用于慢性宮頸炎之宮頸糜爛及中醫(yī)辨證屬于濕熱瘀阻者。

HPV病毒具有高度的宿主和組織特異性，只能特異性感染人的黏膜、皮膚上皮細(xì)胞，并且依賴上皮細(xì)胞的分化進(jìn)行復(fù)制，因此目前尚無法對(duì)HPV病毒進(jìn)行有效的體外培養(yǎng)，同時(shí)也缺乏合適的天然動(dòng)物模型，通過構(gòu)建HPV假病毒成為目前研究HPV簡單有效的方法[5]。本研究通過多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染方法構(gòu)建了HPV6、HPV11假病毒，對(duì)該HPV假病毒的感染能力進(jìn)行了分析，并利用該假病毒成功建立了HPV感染小鼠陰道模型。通過研究椿乳凝膠對(duì)HPV6、HPV11假病毒感染的293FT細(xì)胞的形態(tài)和增殖、細(xì)胞周期的影響，以及椿乳凝膠對(duì)HPV6、HPV11假病毒感染小鼠的影響，綜合評(píng)價(jià)椿乳凝膠對(duì)低危型HPV6、HPV11的藥效作用，為臨床用藥提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠100只，體質(zhì)量15.6～18.8 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010。小鼠飼養(yǎng)于湖南普瑞瑪藥物研究中心有限公司病原微生物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室備案編號(hào)長衛(wèi)計(jì)實(shí)備字（2021）第B010號(hào)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（湘）2020-0015。動(dòng)物研究遵循湖南普瑞瑪藥物研究中心有限公司動(dòng)物倫理委員會(huì)的指導(dǎo)方針，倫理批準(zhǔn)號(hào)IACUC-2021（3）037。

1.2 細(xì)胞

人胚腎293FT細(xì)胞購自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.3 儀器

BCR-MI02-72-C11-PPSU型小鼠獨(dú)立通氣籠盒系統(tǒng)、BSC1300-Ⅱ-B2型生物安全柜（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；ST8R型臺(tái)式高速大容量冷凍離心機(jī)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；流式細(xì)胞儀（BD公司）；Spectra Max i3x型酶標(biāo)儀（Molecular Devices公司）；5200 Multi型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、雙垂直電泳儀、轉(zhuǎn)印電泳儀（Tanon公司）；倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司）；AniView100型多模式動(dòng)物活體成像系統(tǒng)（廣州博鷺騰生物科技有限公司）。

1.4 藥品與試劑

椿乳凝膠（批號(hào)20191205）由株洲千金藥業(yè)股份有限公司提供；報(bào)告質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP-HPV6-E6/E7、pcDNA3.1-EGFP-HPV11-E6/E7送至通用生物（安徽）系統(tǒng)有限公司合成；表達(dá)質(zhì)粒pCMV-HPV6-L1-flag-L2-6*His、pCMV-HPV11-L1-flag-L2-6*His送至武漢中邁盈科生物科技有限公司合成；DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)AF29584966）購自HyClone公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，批號(hào)M009-6）購自Sciencell公司；Lipo-fectamine 2000（批號(hào)2117484）、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（批號(hào)2117484）購自Invitrogen公司；Opti-MEM?（批號(hào)31985070）、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（批號(hào)4368814）、PowerUP SYBR Green Master Mix（批號(hào)A25742）、Prestained Protein Ladder（批號(hào)26617）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；CellTiter-Glo發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒（批號(hào)C0065M）、RIPA裂解液（強(qiáng)）（批號(hào)P0013B）、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒（批號(hào)P0012AC）、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號(hào)P0018A）購自碧云天生物試劑公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞（批號(hào)CB101）、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒（批號(hào)DP117）購自天根生化科技（北京）有限公司；RNA提取試劑盒（批號(hào)RC101）購自Vazyme；β-actin引物（批號(hào)H309KA9183）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PVDF膜（批號(hào)IPVH00010）購自Merck Millipore；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)AS014）、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（批號(hào)AS003）、β-actin抗體（批號(hào)AC026）購自Abclonal公司；HPV6 E7抗體（批號(hào)LS-C144095）購自LSBio公司；HPV11 E7抗體（批號(hào)ab100967）購自英國Abcam公司；鬼臼毒素（批號(hào)M0521B）購自蘇州美侖生物科技有限公司；苯甲酸雌二醇注射液（批號(hào)20190312）購自四川金科藥業(yè)有限責(zé)任公司。

2 方法

2.1 HPV6、HPV11假病毒構(gòu)建

2.1.1 質(zhì)粒常規(guī)轉(zhuǎn)化與大量提取 從?80 ℃冰箱取出4管DH5α感受態(tài)細(xì)胞置冰上，分別向4管感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入0.5～1.0 μL預(yù)冷的目的質(zhì)粒，加入預(yù)熱的200 μL LB液體培養(yǎng)基，混勻后于37 ℃、200 r/min搖床振蕩1 h。吸取細(xì)胞加到含相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12～15 h。挑取平板上單個(gè)菌落接種（或直接取對(duì)應(yīng)合成質(zhì)粒的菌液100～200 μL）至2 mL含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，Nanodrop測(cè)定質(zhì)粒純度與濃度，于?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 結(jié)構(gòu)基因表達(dá)質(zhì)粒與報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293FT細(xì)胞 轉(zhuǎn)染前1 d，按1×106/mL的密度將293FT細(xì)胞鋪于6孔板中，37 ℃培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞長至密度約為70%時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，利用Lipo-fectamine 2000將結(jié)構(gòu)基因表達(dá)質(zhì)粒分別與報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293FT細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置分別轉(zhuǎn)染單個(gè)報(bào)告質(zhì)粒為陰性對(duì)照組。①轉(zhuǎn)染前0.5 h把培養(yǎng)孔板中的DMEM完全培養(yǎng)基換成無血清的DMEM培養(yǎng)基，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理，且用量減半；②首先將轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、對(duì)照組質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)組質(zhì)粒（pcDNA3.1-EGFP-HPV6/11-E6/E7：pCMV-HPV6-L1-flag-L2-6*His＝1∶1，2種質(zhì)粒均取1.25 μg）分別用Opti-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，放置5 min；③將Lipofectamine 2000分別與對(duì)照組質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)組質(zhì)粒混合，漩渦混勻，放置20 min；④將轉(zhuǎn)染混合液加入已換成無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中，48～72 h后收獲假病毒，進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。

2.1.3 病毒滴度測(cè)定 將293FT細(xì)胞按1.5×104/mL的密度鋪于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將HPV6/11假病毒用DMEM培養(yǎng)基分別進(jìn)行0.1、0.01、1×10?3、1×10?4、1×10?5倍稀釋，取各梯度病毒稀釋液100 μL加入293FT細(xì)胞中，每個(gè)稀釋梯度8個(gè)復(fù)孔，將96孔板放入37 ℃培養(yǎng)箱孵育72 h后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察，出現(xiàn)1個(gè)以上病變細(xì)胞定為陽性孔。用Reed-Muench方法計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)半數(shù)感染量（half of tissue culture infective dose，TCID50），即病毒感染一半細(xì)胞時(shí)的病毒稀釋度。

2.2 椿乳凝膠體外實(shí)驗(yàn)

2.2.1 椿乳凝膠對(duì)293FT細(xì)胞形態(tài)及增殖的影響 將293FT細(xì)胞按1.5×104/mL的密度鋪于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞長成單層細(xì)胞后，用PBS溶液洗滌細(xì)胞2～3次，將椿乳凝膠（40 mg/mL）用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基分別稀釋6個(gè)質(zhì)量濃度（1000、500、250、125、62.5、31.25 μg/mL）；鬼臼毒素設(shè)置6個(gè)濃度（100、50、25、12.5、6.25、3.125 μmoL/L），取每組藥物100 μL加入96孔板中，同時(shí)設(shè)置溶媒對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24、48、72 h后于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，采用CellTiter-Glo發(fā)光法測(cè)定72 h后的細(xì)胞活性，并計(jì)算椿乳凝膠和鬼臼毒素的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）及TC0（IC20），共重復(fù)3次。

2.2.2 椿乳凝膠對(duì)HPV6、HPV11假病毒感染力的影響 將293FT細(xì)胞按1.5×104/mL的密度鋪于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。用培養(yǎng)基將椿乳凝膠（125 μg/mL）和鬼臼毒素（3.12 μmoL/L）進(jìn)行多濃度稀釋。待細(xì)胞長滿約80%時(shí)棄培養(yǎng)液加入100倍TCID50病毒液，100 μL/孔，再加入100 μL/孔的椿乳凝膠（125 μg/mL）和鬼臼毒素（3.12 μmoL/L），同時(shí)設(shè)置溶媒對(duì)照組（單純加入DMEM培養(yǎng)基），每組8個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24～72 h后。共重復(fù)3次，于倒置熒光顯微鏡下觀察并記錄實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的細(xì)胞病變情況。

2.2.3 椿乳凝膠對(duì)293FT細(xì)胞周期的影響 將293FT細(xì)胞按1.5×106/孔的密度鋪于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞長至80%左右時(shí)，用PBS溶液洗滌細(xì)胞2～3次，加入100倍TCID50病毒液，100 μL/孔。在100 μL/孔培養(yǎng)基中分別加入低、中、高質(zhì)量濃度（32.3、64.6、129.2 μg/mL）的椿乳凝膠和鬼臼毒素（3.12 μmoL/L），同時(shí)設(shè)置病毒對(duì)照組和溶媒對(duì)照組。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育48 h后，1000 r/min離心3 min收集細(xì)胞；加入10 μL碘化丙啶（PI）至終質(zhì)量濃度為20 μg/mL（用190 μL 1×Binding Buffer稀釋），4 ℃避光染色30 min，離心；加入200 μL 1×Binding Buffer清洗，離心；加入200 μL PBS溶液重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期數(shù)據(jù)的收集和分析（單次流式細(xì)胞儀檢測(cè)，1份樣品細(xì)胞數(shù)量約106）。

2.2.4 椿乳凝膠對(duì)293FT細(xì)胞凋亡的影響 將293FT細(xì)胞按1.5×106/孔的密度鋪于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞長至80%左右時(shí)，用PBS溶液洗滌細(xì)胞2～3次，加入制備得到的100倍TCID50的HPV6和HPV11假病毒液，100 μL/孔。繼續(xù)培養(yǎng)2 h后更換為低、中、高質(zhì)量濃度（32.3、64.6、129.2 μg/mL）的椿乳凝膠和鬼臼毒素（3.12 μmoL/L），100 μL/孔，同時(shí)設(shè)置病毒對(duì)照組和溶媒對(duì)照組。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育48 h后，1000 r/min離心3 min收集細(xì)胞，用PBS輕輕吹打洗滌細(xì)胞2次，用200 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，再用195 μL細(xì)胞懸液中加入Annexin V-FITC，室溫混合孵育10 min；加入200 μL 1×Binding Buffer洗滌細(xì)胞，再用190 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入PI室溫孵育10 min后，加入200 μL 1×Binding Buffer清洗細(xì)胞；加入200 μL PBS溶液重懸細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，共重復(fù)3次。

2.3 椿乳凝膠對(duì)HPV6、HPV11假病毒感染BALB/c小鼠模型的影響

2.3.1 造模、分組與給藥 取雌性BALB/c小鼠100只，每只動(dòng)物sc 0.1 μg苯甲酸雌二醇，1次/d，連續(xù)3 d，第3天下午取25 μL HPV假病毒與15 μL 4%羧甲基纖維素（CMC）的混合物灌入小鼠陰道內(nèi)進(jìn)行感染，另取16只對(duì)照組小鼠灌入40 μL的4% CMC進(jìn)行處理；假病毒感染48 h之后，乙醚輕微麻醉小鼠，利用多模式動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)小鼠陰道內(nèi)熒光的表達(dá)情況。選取造模成功的BALB/c小鼠80只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、鬼臼毒素組（1 mg/只）和椿乳凝膠低、中、高劑量（0.01、0.02、0.04 g/只）組，每組16只。采用稱量好的陰道裝藥器經(jīng)陰道推注相應(yīng)的藥物，1次/d，連續(xù)20 d。

2.3.2 pH值檢測(cè) 分別于給藥后10、20 d采用無菌棉簽進(jìn)行陰道分泌物的取樣。取材部位為小鼠的宮頸口或?qū)m頸后穹窿，分泌物使用一次性無菌陰道拭子采集，圓周滾動(dòng)3次，采用0.1級(jí)精密pH試紙檢測(cè)陰道分泌物的pH值。

2.3.3 組織病理檢查 末次給藥后各組選取8只動(dòng)物頸椎脫臼處死，解剖取陰道、子宮組織進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色觀察小鼠陰道、子宮及子宮頸組織形態(tài)學(xué)變化。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[6-7]：上皮細(xì)胞正常，且未見炎癥細(xì)胞浸潤，計(jì)為0分；上皮細(xì)胞壞死，計(jì)為1分；上皮細(xì)胞壞死及增生，計(jì)為2分；上皮細(xì)胞壞死及增生，且炎癥細(xì)胞浸潤，計(jì)為3分。

2.3.4 宮頸組織病毒滴度檢測(cè) 取一定量的組織勻漿，離心取上清液，在96孔板中接種293T細(xì)胞，第2天用完全培養(yǎng)基按（1～1×10?9）10個(gè)梯度稀釋病毒液，每孔加入100 μL稀釋后的病毒液，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔；48 h后觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達(dá)，若1×10?8梯度孔中分別有2、3、4個(gè)細(xì)胞GFP，則取平均值，此病毒滴度為3×108TU/mL。采用血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)宮頸懸液的血凝抑制滴度（以完全抑制紅細(xì)胞凝集的最大稀釋倍數(shù)為血凝抑制滴度），以log2（最大稀釋倍數(shù)），反映宮頸中病毒效價(jià)。

2.3.5、mRNA檢測(cè) 取各組宮頸組織，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)，根據(jù)Genbank里的基因數(shù)據(jù)，使用Primer Premier 6和Oligo 7軟件設(shè)計(jì)引物序列。內(nèi)參為β-actin。設(shè)定對(duì)照基因表達(dá)量為100，以目的基因占對(duì)照基因相對(duì)百分含量代表目的基因表達(dá)量。引物序列：上游引物5’-TGTTTCAGGA- CCCACAGGAG-3’，下游引物5’-TCACGTCGCAG- TAACTGTTG-3’；上游引物5’-CAGCTC- AGAGGAGGAGGATG-3’，下游引物5’-AACCGA- AGCGTAGAGTCACA；上游引物5’-CACTATAGAGGCCAGTGCCA-3’，下游引物5’-CTTGTGTTTCTCTGC GTC GT；上游引物5’-CGAACCACAACGTCACACAA-3’，下游引物5’-AGAAACAGCTGCTGGAATGC-3’。

2.3.6 HPV6、HPV11 E7蛋白表達(dá) 留取樣本用BCA法測(cè)定蛋白濃度，制備分離膠、濃縮膠，上樣，電泳。將電泳后凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，ECL顯色曝光。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量為目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值比值。

2.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果用表示，多組間比較采用方差分析。

3 結(jié)果

3.1 椿乳凝膠體外實(shí)驗(yàn)

3.1.1 HPV6、11假病毒滴度測(cè)定 HPV6/11假病毒滴度測(cè)定結(jié)果見表1。根據(jù)公式lgTCID50＝lg（高于50%的死亡百分?jǐn)?shù)的稀釋度）＋（距離比例×lg稀釋倍數(shù)）可知，TCID50終點(diǎn)稀釋比例為1∶630.95，即測(cè)定HPV6/11假病毒中，每0.1 mL接種量含有630個(gè)TCID50單位。因此，把HPV6/11假病毒原液用DMEM培養(yǎng)基按照1∶6.3倍稀釋即可得100 TCID50。

3.1.2 椿乳凝膠對(duì)293FT細(xì)胞形態(tài)及增殖的影響 如表2所示，椿乳凝膠對(duì)293FT細(xì)胞的IC50為333.80 μg/mL，TC0為129.20 μg/mL，鬼臼毒素在100～3.12 μmol/L濃度對(duì)293FT細(xì)胞的毒性差異不大，實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)未檢測(cè)到鬼臼毒素對(duì)293FT細(xì)胞的IC50和TC0。加入椿乳凝膠溶液（1000～31.25 μg/mL）處理24～72 h后對(duì)293FT細(xì)胞形態(tài)的影響見圖1，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)呈圓形，棱角分明。與對(duì)照組比較，椿乳凝膠干預(yù)組中細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯變化，以細(xì)胞脫落，皺縮為主，提示藥物干預(yù)后細(xì)胞增殖受到一定的抑制作用。

表1 HPV6/11假病毒的滴度測(cè)定出現(xiàn)CPE孔的統(tǒng)計(jì)(, n = 8)

Table 1 Statistics of CPE wells in titer determination of HPV6/11 pseudovirus (, n = 8)

病毒稀釋度出現(xiàn)CPE孔數(shù)無CPE孔數(shù)累計(jì)出現(xiàn)CPE孔占比/% 1×10?180100.0 1×10?280100.0 1×10?33537.5 1×10?42625.0 1×10?5080

表2 椿乳凝膠和鬼臼毒素對(duì)293FT細(xì)胞的毒性結(jié)果(, n = 3)

Table 2 Toxicity results of Chunru Gel and podophyllotoxin on 293FT cells (, n = 3)

藥物質(zhì)量濃度/(μg·mL?1)抑制率/%IC50/(μg·mL?1)TC0/(μg·mL?1) 椿乳凝膠1000.0066.53±0.83309.09129.14 500.0053.34±0.74 250.0048.95±0.25 125.0019.01±0.66 62.508.88±0.95 31.251.96±0.30 鬼臼毒素100.0066.04±0.85// 50.0063.18±0.67 25.0063.21±1.34 12.5061.45±0.91 6.2559.64±0.87 3.1261.92±1.85

圖1 椿乳凝膠對(duì)293FT細(xì)胞形態(tài)的影響

3.1.3 椿乳凝膠對(duì)HPV6、HPV11假病毒感染力的影響 如圖2所示，與溶媒對(duì)照組比較，病毒感染48 h后，病毒對(duì)照組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的增殖速度減慢，細(xì)胞碎片增多、細(xì)胞間的間隙增大等病變現(xiàn)象。與病毒對(duì)照組比較，椿乳凝膠干預(yù)后細(xì)胞病變程度明顯減少，表明其有一定抑菌病毒增殖的能力；至培養(yǎng)72 h后，椿乳凝膠抑制病毒的效果呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，病毒對(duì)照組與椿乳凝膠干預(yù)組出現(xiàn)細(xì)胞病變的差異性不大，鬼臼毒素在72 h表現(xiàn)出一定抑制病毒增殖的能力。提示隨著時(shí)間的延長椿乳凝膠抗病毒的能力慢慢減弱，需連續(xù)給藥增強(qiáng)藥效。綜上所述，椿乳凝膠對(duì)HPV6/HPV11病毒的感染有一定的抑制作用。

3.1.4 椿乳凝膠對(duì)293FT細(xì)胞周期的影響 PI單染流式細(xì)胞儀分析293FT細(xì)胞周期中各期細(xì)胞的變化，結(jié)果見圖3。HPV6/HPV11感染48 h后，細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞比例顯著低于溶媒對(duì)照組，S期細(xì)胞比例高于溶媒對(duì)照組，G2/M細(xì)胞比例與溶媒對(duì)照組相比無顯著差異。椿乳凝膠低、中、高劑量組G0/G1期細(xì)胞比例顯著高于HPV6/HPV11組，S期細(xì)胞比例低于HPV6/HPV11組，G2/M細(xì)胞比例低于HPV6/HPV11組。椿乳凝膠組G0/G1期細(xì)胞比例低于溶媒對(duì)照組，與鬼臼毒素組相比G0/G1期細(xì)胞比例無顯著差異。

3.1.5 椿乳凝膠對(duì)293FT細(xì)胞凋亡的影響 如圖4所示，經(jīng)Annexin V-FITC染色后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，經(jīng)假病毒處理的病毒對(duì)照組293FT細(xì)胞凋亡率明顯低于溶媒對(duì)照組，提示HPV假病毒能抑制細(xì)胞凋亡。經(jīng)鬼臼毒素和低、中、高劑量椿乳凝膠處理后的293FT細(xì)胞凋亡率明顯高于病毒對(duì)照，并且椿乳凝膠具有劑量相關(guān)性。

3.2 椿乳凝膠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

3.2.1 一般觀察結(jié)果（定植檢查） 造模后48 h通過動(dòng)物活體成像系統(tǒng)對(duì)HPV定植進(jìn)行檢查，如圖5所示，模型組熒光強(qiáng)度高，且造模后22 d模型組熒光強(qiáng)度仍然較高，提示HPV在陰道體內(nèi)定植良好，維持時(shí)間較長。一般臨床觀察顯示給藥后各組動(dòng)物一般情況（自主活動(dòng)、攝食攝水等）均未見異常，且陰道外觀無明顯分泌物和紅腫。

圖2 椿乳凝膠對(duì)假病毒感染293FT細(xì)胞的影響

圖3 PI單染流式細(xì)胞儀分析293FT細(xì)胞周期

圖4 椿乳凝膠對(duì)293FT細(xì)胞凋亡的影響(, n = 3)

圖5 模型組HPV定植檢查

3.2.2 對(duì)陰道pH的影響 如表3所示，與對(duì)照組比較，給藥第10、20天模型組陰道pH值明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，給藥第10天鬼臼毒素組和椿乳凝膠低、高劑量組陰道pH值均明顯降低（＜0.05、0.01），給藥第20天各給藥組陰道pH值均明顯降低（＜0.01）。

3.2.3 對(duì)宮頸組織病毒滴度的影響 如表4所示，與對(duì)照組比較，模型組宮頸組織病毒滴度明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組宮頸組織病毒滴度均明顯降低（＜0.01）。

3.2.4 組織病理學(xué)鏡下觀察 如圖6所示，對(duì)照組僅個(gè)別動(dòng)物陰道及宮頸組織鏡下可見黏膜上皮細(xì)胞壞死，并伴有少量炎癥細(xì)胞浸潤；模型組宮頸及陰道上皮細(xì)胞壞死，部分動(dòng)物出現(xiàn)上皮細(xì)胞增生，上皮層及黏膜固有層炎癥細(xì)胞浸潤；各給藥組陰道及宮頸組織鏡下均可見黏膜上皮細(xì)胞變性壞死，伴有少量炎性細(xì)胞浸潤。小鼠造模后經(jīng)陰道給予不同劑量的椿乳凝膠，陰道組織病變程度變化不明顯，宮頸組織病變有不同程度的減輕。連續(xù)給藥20 d后，各組動(dòng)物子宮組織鏡下觀察未見上皮細(xì)胞增生、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤。

表3 椿乳凝膠對(duì)陰道pH值的影響(, n = 8)

Table 3 Effect of Chunru Gel on vaginal pH (, n = 8)

組別劑量/(g·只?1)pH值 第10天第20天 對(duì)照－6.3±0.26.4±0.2 模型－6.9±0.5##7.0±0.5## 鬼臼毒素0.0016.5±0.2*6.5±0.1** 椿乳凝膠0.016.4±0.3**6.2±0.3** 0.026.5±0.26.4±0.2** 0.046.4±0.2*6.3±0.2**

與對(duì)照組比較：##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同

##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as below tables

表4 椿乳凝膠對(duì)宮頸組織病毒滴度的影響(, n = 8)

Table 4 Effect of Chunru Gel on cervical tissue virus titer (, n = 8)

組別劑量/(g·只?1)log2末次給藥病毒滴度 對(duì)照－0.0±0.0 模型－4.4±0.7## 鬼臼毒素0.0012.6±0.7** 椿乳凝膠0.013.1±0.4** 0.022.1±0.4** 0.041.6±0.5**

圖6 各組小鼠陰道、宮頸組織病理切片(HE, ×100)

3.2.5 組織病理學(xué)評(píng)分 如表5所示，與對(duì)照組比較，模型組宮頸組織病變?cè)u(píng)分明顯升高（＜0.01），陰道組織病變?cè)u(píng)分有增加趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與模型組比較，鬼臼毒素組和椿乳凝膠中、高劑量組宮頸組織病變?cè)u(píng)分均明顯降低（＜0.05、0.01）。各給藥組陰道組織病變?cè)u(píng)分與模型組比較，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3.2.6 對(duì)HPV6、HPV11的E7蛋白表達(dá)的影響 如圖7所示，與對(duì)照組比較，模型組HPV6、HPV11的E7蛋白表達(dá)水平均明顯增加（＜0.01）；與模型組比較，鬼臼毒素組HPV6、HPV11的E7蛋白表達(dá)水平明顯降低（＜0.01），椿乳凝膠各劑量組HPV11的E7蛋白表達(dá)水平均明顯降低（＜0.05、0.01），椿乳凝膠中、高劑量組HPV6的E7蛋白表達(dá)水平均明顯降低（＜0.05、0.01）。

表5 椿乳凝膠對(duì)組織病變?cè)u(píng)分的影響(, n = 8)

Table 5 Effect of Chunru Gel on histopathological score(, n = 8)

組別劑量/(g·只?1)陰道組織病變?cè)u(píng)分宮頸組織病變?cè)u(píng)分 對(duì)照－0.4±0.70.1±0.4 模型－0.9±1.01.9±0.4## 鬼臼毒素0.0011.0±0.51.0±0.9* 椿乳凝膠0.011.1±0.81.4±0.7 0.020.8±0.70.9±0.6** 0.041.3±0.71.3±0.7*

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

3.2.7 對(duì)、mRNA表達(dá)的影響 如圖8所示，對(duì)照組小鼠宮頸組織中未檢測(cè)到mRNA表達(dá)；模型組小鼠宮頸組織mRNA表達(dá)水平均明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，鬼臼毒素組、mRNA均明顯降低（＜0.05、0.01），椿乳凝膠低劑量組、mRNA均明顯降低（＜0.05），椿乳凝膠中、高劑量組、mRNA均明顯降低（＜0.05、0.01）。

圖8 椿乳凝膠對(duì)小鼠宮頸組織HPV6、HPV11 E6/E7 mRNA表達(dá)的影響(, n = 6)

4 討論

尖銳濕疣（condyloma acuminatum，CA）也叫生殖器疣、性病疣，是一種由HPV病毒感染引起的性傳播疾病，主要引起生殖器、肛門部位增生性損害[8]。據(jù)報(bào)道，全球每10萬人中就有近200人感染CA。美國每年用于CA的直接醫(yī)療費(fèi)用約1.77億美元，而在發(fā)展中國家，CA造成的影響更加嚴(yán)重[9-11]。CA傳染性強(qiáng)，并且有一定潛伏期，導(dǎo)致發(fā)病率逐年升高[12]。目前CA治療手段多局限于去除疣體及HPV感染組織，非針對(duì)HPV的病原學(xué)治療，因此該病容易復(fù)發(fā)[13]。研究表明，90%以上的CA都與HPV6和HPV11 2種基因型有關(guān)[14-15]。

HPV是乳多空病毒科乳頭瘤空泡病毒A屬的病毒，只特異性感染人的上皮細(xì)胞，依靠上皮細(xì)胞的分化途徑來完成其生命周期。HPV可能通過上皮表面的微磨損感染上皮基底層的細(xì)胞，利用伴隨傷口愈合的基底細(xì)胞的橫向延伸進(jìn)入細(xì)胞[16]。HPV感染上皮細(xì)胞后，癌蛋白E6、E7可以通過各種機(jī)制逃避宿主的免疫系統(tǒng)監(jiān)測(cè)，并且將自身基因整合進(jìn)人基因組，使得病毒免于被免疫系統(tǒng)清除。E6和E7還能共同促進(jìn)細(xì)胞增殖、延長細(xì)胞周期進(jìn)程并防止細(xì)胞凋亡，使得病毒大量復(fù)制。衣殼蛋白L1和L2在上皮的最表層表達(dá)，并且進(jìn)行病毒組裝，最后，新的感染性病毒顆粒從上皮表面脫落[17-18]。

盡管目前對(duì)于HPV已經(jīng)有廣泛研究，然而對(duì)于低危型HPV的可用數(shù)據(jù)仍然有限。有研究顯示在中國西南地區(qū)，HPV6是第2流行的HPV類型，同時(shí)也是最流行的低危型HPV[19]。因此本研究以最常見的5種低危型HPV類型HPV6、HPV11為研究對(duì)象，評(píng)價(jià)椿乳凝膠在體內(nèi)外對(duì)于低危型HPV的抑制作用。

由于HPV真病毒的復(fù)制具有嚴(yán)格的宿主特異性和細(xì)胞分化依賴性，因此目前并沒有成功建立HPV體外培養(yǎng)體系，也缺乏合適的動(dòng)物感染模型，構(gòu)建假病毒成為目前HPV研究快速有效的方法。研究發(fā)現(xiàn)，將HPV結(jié)構(gòu)蛋白、基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，可以極大提高其在細(xì)胞中蛋白的表達(dá)，而這2種蛋白能夠自我組裝成病毒樣顆粒（virus-like particles，VLP），其可以將外源性報(bào)告質(zhì)粒包裹進(jìn)病毒顆粒內(nèi)，形成與天然病毒結(jié)構(gòu)相似的假病毒，具有單次感染細(xì)胞的能力，通過檢測(cè)報(bào)告質(zhì)粒的表達(dá)可以間接反映病毒的感染情況[20-21]。

椿乳凝膠為株洲千金藥業(yè)股份有限公司自主開發(fā)并獨(dú)家生產(chǎn)的中藥制劑，由椿皮、苦參、牡丹皮、乳香、冰片5味中藥組方而成，具有清熱燥濕、祛瘀生肌的功效，主要用于慢性宮頸炎之宮頸糜爛及中醫(yī)辨證屬于濕熱瘀阻者。根據(jù)其功能主治的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)椿乳凝膠體內(nèi)及體外抗低危型HPV病毒的藥效學(xué)作用展開了研究。本研究成功建立了HPV6、HPV11假病毒感染293FT細(xì)胞的體外模型，發(fā)現(xiàn)假病毒能使細(xì)胞產(chǎn)生病變，影響細(xì)胞周期變化，并且抑制細(xì)胞凋亡。椿乳凝膠干預(yù)可以顯著降低假病毒細(xì)胞感染能力，恢復(fù)細(xì)胞正常周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。同時(shí)本研究利用HPV6、HPV11假病毒建立了雌性小鼠生殖器感染體內(nèi)模型，病毒感染上皮細(xì)胞后其包裹的報(bào)告基因可以立即表達(dá)，通過小動(dòng)物體內(nèi)可見光成像系統(tǒng)檢測(cè)GFP熒光表達(dá)可以反映假病毒在上皮細(xì)胞中的感染情況。研究結(jié)果顯示，HPV6、HPV11假病毒成功感染小鼠，宮頸組織中病毒滴度顯著升高，并且HPV6、HPV11的E7蛋白和、基因表達(dá)水平明顯升高。同時(shí)宮頸組織上皮細(xì)胞出現(xiàn)增生和壞死，伴有明顯炎性浸潤，陰道pH值明顯升高，研究顯示正常陰道的酸性環(huán)境可以維持陰道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，抵御HPV感染[22]。椿乳凝膠給藥后，可以有效降低假病毒感染小鼠宮頸組織中的病毒滴度，抑制HPV6、HPV11的E7蛋白和其、基因的表達(dá)，保護(hù)宮頸上皮細(xì)胞。

綜上所述，通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證明椿乳凝膠可以明顯抑制低危型HPV復(fù)制，減輕低危型HPV感染引起的組織病變。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of Chunru Gel on low risk human papillomavirus

WU Meng-yao1, PENG Dong-dong2, 3, GONG Yun1, PENG Yin2, 3, ZHANG Peng1, ZHANG Xiao-dong2, 3, TANG Xiao-yan2, 3, ZHANG Miao-hong2, 3, JIANG De-jian2, 3

1. Zhuzhou Qianjin Pharmaceutical Co., Ltd., Zhuzhou 412000, China 2. Hunan Key Laboratory of Pharmacodynamics and Safety Evaluation of New Drugs, Changsha 410331, China 3. Hunan Prima Drug Research Center Co., Ltd., Changsha 410331, China

To study the effect of Chunru Gel (椿乳凝膠) against low risk human papillomavirus (HPV).Low-risk HPV6 and HPV11 pseudovirus-infected human embryonic kidney 293FT cells model was established, and effect of Chunru Gel on HPV infection and cell cycle was evaluated. HPV6 and HPV11 pseudoviruses were injected into vagina of female mice pretreated with estradiol benzoate to establish HPV infected animal models. After virus infection 48 h, virus colonization was detected. The mice models were randomly divided into model group, podophyllotoxin (1 mg/animals) and low-, medium-and high-dose (0.01, 0.02, 0.04 g/animal) Chunru Gel groups, and control group were set up, with 16 animals in each group. The corresponding drugs were administered vaginally once a day for 20 consecutive days. The appearance and pH value of the vagina and cervix of mice were detected on the 10th and 20th day of administration, respectively. After the last administration, the histopathological changes of the vagina and cervix of mice, as well as the viral titer of HPV6 and HPV11 pseudoviruses, and the expression of,genes and proteins were observed to evaluate theinhibitory effect of Chunru Gel on low risk HPV virus.The results oftest showed that Chunru Gel had a certain inhibitory effect on infectivity of HPV6 and HPV11 pseudoviruses and cell cycle changes. The results ofexperiments showed that Chunru Gel reduced the infection ability of HPV6 and HPV11 pseudovirus (< 0.01), reduced the vaginal pH value of mice (< 0.01), alleviated cervical tissue lesions (< 0.05, 0.01), and inhibited HPV6, HPV11 pseudovirus,gene and protein expressions (< 0.05, 0.01.HPV6 and HPV11 pseudoviruses can better simulate the infection process of low-risk HPV virus, while Chunru Gel has obvious inhibitory effect on low-risk HPV virus, and has a certain therapeutic effect on infection caused by low-risk HPV virus.

low-risk human papillomavirus; HPV6; HPV11; pseudoviruses; Chunru Gel

R285.5

A

0253 - 2670(2022)14 - 4399 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.14.019

2022-04-15

湖南省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2020DK2003）

吳夢(mèng)瑤，女，碩士研究生，從事中藥藥理作用研究。Tel: 17369278531 E-mail: wmyao1995@qq.com

姜德建，男，博士，碩士生導(dǎo)師，研究員，從事新藥藥效與安全性評(píng)價(jià)。Tel: 13875802695 E-mail: jiangdejian@hnse.org

#共同第一作者：彭冬冬，男，碩士研究生，助理研究員，從事新藥藥效與安全性評(píng)價(jià)。Tel: 18229760205 E-mail: pengdongdong@hnse.org

[責(zé)任編輯 李亞楠]