藜蘆bHLH轉錄因子分析鑒定

寇呈熹，佟金泉，馬 瑞，孫 偉，薛哲勇*，麻鵬達*

藜蘆bHLH轉錄因子分析鑒定

寇呈熹1, 2，佟金泉3，馬 瑞4，孫 偉5，薛哲勇1, 2*，麻鵬達3*

1. 東北林業大學 東北鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040 2. 東北林業大學 黑龍江省植物天然活性物質的合成與利用重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040 3. 西北農林科技大學生命科學學院，甘肅 楊凌 712100 4. 吉林省農業科學院 生物技術研究所 吉林省農業生物技術重點實驗室，吉林 長春 130033 5. 中國中醫科學院中藥研究所 中藥鑒定與安全性評估北京市重點實驗室，北京 100700

基于轉錄組數據，利用生物信息學方法鑒定藜蘆bHLH轉錄因子基因家族，并作初步分析。通過隱馬可夫模型從藜蘆轉錄組序列中篩選基因，并使用ExPASy、MEME等在線網站及MEGA、TBtools等軟件對藜蘆bHLH進行理化性質、保守基序等可視化分析。在藜蘆轉錄組中共鑒定到72條bHLH轉錄因子，VnbHLH轉錄因子氨基酸數目為105～692，等電點介于4.69～11.47，相對分子質量為11 071.2～77 795.3，亞細胞定位分析顯示VnbHLH均定位于細胞核中；系統發育分析將VnbHLH轉錄因子分為6個亞族，VnbHLH在不同組織中表達差異顯著，Vn_54312、Vn_14037在根中表達較高，推測其可能參與了藜蘆植物根部某些生物堿的合成。根據轉錄組數據分析了藥用植物藜蘆中的bHLH轉錄因子基因家族，有助于下一步對藜蘆bHLH轉錄因子家族功能預測及驗證。

藜蘆；轉錄組；bHLH轉錄因子；系統進化；基因表達

藜蘆L.為百合科（Liliaeeae）多年生單子葉植物，全世界約有40種，分布于亞洲、北美和歐洲，中國約有17種，常見于高海拔、潮濕、酸性的土壤環境[1]。黎蘆植物的大部分組織均可供藥用，可內服治療中風痰壅、喉痹不通、癲癇、頭痛、黃疽、瘧疾、骨折[2-3]，外用治疥癬、滅蠅蛆[4-5]。其本品作為中醫藥物收載于《本草綱目》中已有一千多年歷史，在當代仍作為涌吐風痰藥物使用，但藜蘆自身被列為中藥配伍禁忌中的十八反[6]，在臨床應用中存在一定限制。藜蘆屬植物的化學活性成分包括甾體生物堿類、肽類、黃酮類等，起主要作用的是甾體類生物堿。目前，已經從藜蘆植物中分離出184種[1]甾體類生物堿，如環靶明、藜蘆胺、介藜蘆堿等，具有抗腫瘤、抗炎鎮痛、抗血栓、降血壓等多種藥理活性。

環靶明（環巴胺，11-去氧芥芬胺，cyclopamine）是藜蘆植物中的一種甾體類生物堿，主要存在于百合科黎蘆屬植物的根系中。環靶明的發現源于其致畸作用，20世紀中期，Keeler等[7]研究了美國愛達荷州（Idaho）高概率的羔羊頭部單眼畸形現象后，發現藜蘆屬植物加州藜蘆L.中的一種甾體類生物堿為致畸主要成分并確定了其結構，即環靶明。直到20世紀90年代，環靶明才被發現對Hedgehog信號通路[8]有特定的抑制作用[9]，并從原理上解釋了它的致畸性。由于Hedgehog信號通路與多種腫瘤的生長有關聯[10]，故環靶明可作為一種潛在的抗癌癥藥物。

作為第二大類轉錄因子，bHLH轉錄因子基因家族廣泛存在于動物、植物及微生物中。其家族成員在植物生長發育、次生代謝、環境脅迫應答中起調控作用[11]，由堿性螺旋-環-螺旋特征結構而得名。有關bHLH轉錄因子的研究多以動物為對象，而在植物中主要為水稻及擬南芥等少數植物。bHLH轉錄因子的主要結構是一段貫穿真核生物生命的高度保守的肽序列，它為轉錄因子提供了2個關鍵的分子作用——DNA結合及轉錄調控[12]。bHLH結構域包含大約60個氨基酸，有2個功能不同的區域，基本區域和HLH[13]區域。堿基區有15個氨基酸長，通常包括6個堿基殘基。它位于該結構域的N端，功能為DNA結合基序[14]。HLH區包含2個兩親α螺旋，中間由一個變長環區隔開。HLH區域作為二聚體區域，可以形成同型二聚體或異型二聚體。通過對擬南芥基因組序列的分析，共鑒定出162個編碼bHLH的基因，根據其系統發育關系將其分為21個亞家族[15]。在水稻L.和大白菜var.Regel基因組中分別鑒定出167和230個bHLH轉錄因子[16-17]。它們分別被分為22亞科和24亞科。系統發育分析表明，植物bHLH蛋白包含26個亞家族，到目前為止，大多數bHLH蛋白在擬南芥中已經被鑒定出功能特征，它們的作用包括調節果實開裂、花藥和表皮細胞發育、激素信號和應激反應[18]。而目前對中藥植物藜蘆相關轉錄因子分析甚少，本實驗將以藜蘆轉錄組數據為基礎，對藜蘆bHLH轉錄因子基因家族進行分析鑒定，為進一步藜蘆bHLH轉錄因子功能研究奠定基礎。

1 材料

藜蘆植物樣品為2017年4月26日吉林省磐石市煙筒山鎮的海拔700 m山坡林下的苗期植株，經東北林業大學薛哲勇教授鑒定為藜蘆L.，采集其根、莖和葉3個部位，并做3次生物學重復，備用。

2 方法

2.1 藜蘆二代、全長轉錄組數據庫獲得

將植物樣品進行總RNA提取，以完成二代測序；將提取的總RNA進行混合，以完成全長轉錄組測序。其中二代測序由Illumina平臺完成，全長測序由PacBio平臺完成。利用BUSCO對去冗余后的轉錄組進行完整性評估。

2.2 藜蘆bHLH基因家族鑒定

通過NCBI在線網站（https://www.ncbi. nlm.nih.gov）下載擬南芥bHLH序列。藜蘆轉錄組數據由本課題組對藜蘆測序獲得。使用perl程序提取藜蘆所有蛋白序列，利用PlantTFDB（http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）網站進行轉錄因子預測。將預測獲得的藜蘆bHLH基因家族成員進行篩選，去除重復轉錄本。在Pfam（http://pfam. xfam.org/）網站下載得到bHLH轉錄因子基因家族隱馬可夫模型（PF00010），利用HMMER search搜索預測的藜蘆bHLH基因家族。冗余序列及無bHLH結構域序列通過NCBI數據庫完成，最終篩選到72個藜蘆bHLH基因家族成員。藜蘆bHLH蛋白相對分子質量、等電點及氨基酸數目等理化性質利用ExPASy網站（http://web.expasy.org/protparam/）進行分析。采用WoLF PSORT在線網站（http://www. gen- script.com/ wolfpsort.html），對藜蘆bHLH轉錄因子家族成員進行亞細胞定位預測。

2.3 藜蘆bHLH蛋白系統發育樹的構建及Motif和保守結構域分析

利用MEGA 7.0軟件內置的Clustal W程序對藜蘆bHLH家族蛋白的氨基酸序列進行多序列比對分析，將比對結果采用鄰接法（neigh-joining，NJ）構建系統發育樹，并進行自舉評估（Bootstrap），重復1000次，缺失值處理方式為配對狀態刪除（pairwise deletion），其他參數使用默認值[19]。通過Evolview在線工具（https://www.evolgenius.info/）對系統發育樹進行美化[20]，運用MEME（http://meme-suite. org/tools/meme）網站分析藜蘆bHLH家族蛋白的基序，基序數量為10，其余參數為默認值[21]。

2.4 藜蘆bHLH蛋白組織表達模式分析

通過Illumina平臺對藜蘆的根、莖和葉3個組織進行了二代轉錄組測序，通過RSEM軟件[22]按照公式FPKM=cDNAFragments/{MappedFragments（Millions）?TranscriptLength（kb）}計算衡量出各個基因絕對表達量的FPKM值。其中cDNA Fragments表示比對到某一轉錄本上的片段數目，即雙端Reads數目；Mapped Fragments（Millions）表示比對到轉錄本上的片段總數，以106為單位；TranscriptLength（kb）：轉錄本長度，以103個堿基為單位。對藜蘆bHLH成員基因表達量（FPKM）使用log2（FPKM）＋1對數轉化處理，利用TBtools繪制藜蘆bHLH表達模式圖。

3 結果與分析

3.1 藜蘆轉錄組測序結果分析

通過對藜蘆植物樣品的全長轉錄組測序，共獲得circular consensus（CCS）read 352 009條，其中全長非嵌合（full length readsnon-chimeric，FLNC）序列308 650條。對全長非嵌合序列進行聚類得到一致序列93 217個，對一致序列進行polish得到高質量一致序列共90 756個，用二代轉錄組數據對低質量一致序列進行校正，校正后與高質量一致序列合并進行去冗余分析得到54 048轉錄本序列。利用BUSCO對去冗余后的轉錄組進行完整性評估，使用OrthoDB作為參考數據庫，其完整覆蓋率（C，complete）達到植物基因庫的73.16%（圖1）。將全長轉錄組上傳到SRA數據庫（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/sra），獲得轉錄組數據庫登錄號（PRJNA734486）。

圖1 轉錄組完整性評估

3.2 藜蘆bHLH轉錄因子家族成員鑒定

通過2次HMMER search搜索，去除差異較大序列（1e-20）共計獲得80個注釋為bHLH的轉錄因子，經過CDD和Pfam數據庫對其保守結構域進行驗證，去除冗余及未獲得結構域驗證的8條序列，最終獲得72個具有典型bHLH結構域的轉錄因子基因家族成員（表1）。將所得序列依次標號為VnbHLH1～VnbHLH72，最長的bHLH蛋白有692個氨基酸殘基（VnbHLH70），最短的有105個氨基酸殘基（VnbHLH60），等電點為4.69～11.47，相對分子質量為11 071.2～77 795.3。72個VnbHLH蛋白均定位于細胞核，推測藜蘆bHLH轉錄因子在細胞核發揮調控功能。

表1 藜蘆bHLH轉錄因子基因家族基本信息

Table 1 Basic information of Veratrum bHLH transcription factor gene family

編號序列名稱長度/aa相對分子質量等電點亞細胞定位 VnbHLH1Vn_1023150355 088 6.23細胞核 VnbHLH2Vn_1057250354 892 6.20細胞核 VnbHLH3Vn_1091650355 088 6.23細胞核 VnbHLH4Vn_1108840644 164 6.45細胞核 VnbHLH5Vn_1217555261 523 7.22細胞核 VnbHLH6Vn_1323151455 921 6.36細胞核 VnbHLH7Vn_1403733737 436 7.13細胞核 VnbHLH8Vn_1455240543 744 8.48細胞核 VnbHLH9Vn_1468735940 041 6.38細胞核 VnbHLH10Vn_1490240543 744 8.48細胞核 VnbHLH11Vn_1514743947 910 5.09細胞核 VnbHLH12Vn_1899044648 040 4.77細胞核 VnbHLH13Vn_2008143747 911 5.64細胞核 VnbHLH14Vn_2036931334 270 7.92細胞核 VnbHLH15Vn_2040831834 753 6.17細胞核 VnbHLH16Vn_2069334736 369 6.31細胞核 VnbHLH17Vn_2080019120 94210.69細胞核 VnbHLH18Vn_2090527430 190 6.31細胞核 VnbHLH19Vn_2172832435 858 6.19細胞核 VnbHLH20Vn_2253725627 735 6.80細胞核 VnbHLH21Vn_2363324226 689 5.82細胞核 VnbHLH22Vn_3257439442 996 8.14細胞核 VnbHLH23Vn_3478618219 804 9.67細胞核 VnbHLH24Vn_3492443948 548 6.30細胞核 VnbHLH25Vn_3771757763 849 7.35細胞核 VnbHLH26Vn_3901765271 076 5.05細胞核 VnbHLH27Vn_3913220022 74611.47細胞核 VnbHLH28Vn_4003231234 299 5.92細胞核 VnbHLH29Vn_4074341946 005 5.31細胞核 VnbHLH30Vn_4091732735 906 7.32細胞核 VnbHLH31Vn_4357764169 727 6.96細胞核 VnbHLH32Vn_4516115917 98210.51細胞核 VnbHLH33Vn_4552032836 240 6.38細胞核 VnbHLH34Vn_4626533136 130 6.19細胞核 VnbHLH35Vn_4640827830 549 6.31細胞核 VnbHLH36Vn_467225227 233 9.25細胞核 VnbHLH37Vn_4717723625 602 8.52細胞核 VnbHLH38Vn_4758830032 079 6.72細胞核 VnbHLH39Vn_4784037941 720 7.15細胞核 VnbHLH40Vn_487964169 727 6.96細胞核 VnbHLH41Vn_5149912414 18510.08細胞核 VnbHLH42Vn_5151255261 509 7.22細胞核 VnbHLH43Vn_5365449053 100 5.91細胞核 VnbHLH44Vn_5388818620 213 8.65細胞核 VnbHLH45Vn_5431232736 308 7.41細胞核 VnbHLH46Vn_5644031734 682 6.17細胞核 VnbHLH47Vn_588369377 795 6.40細胞核 VnbHLH48Vn_5955027831 111 6.07細胞核

續表1

3.3 藜蘆bHLH轉錄因子蛋白保守基序分析

對藜蘆bHLH轉錄因子保守氨基酸Motif進行MEME SUITE分析（圖2），共獲得10個Motif：Motif 1（YIHVRARRGQATDSHSLAERVRREKIS- ERMKYLQELVPGCNK）、Motif 2（TGKASMLD- EIINYVQSLQRQVEFLSMKLA）及Motif 3（LNHVEAERQRREKLNQRFYALRAVVPNISKM- DKASLLGDAISYIKELQRKIKELESE）等。結果（圖3、4）表明50個轉錄因子都含有Motif 1，49個轉錄因子包含Motif 2，在17個轉錄因子中發現了Motif 3，有7個轉錄因子蛋白含有Motif 4，有6個轉錄因子蛋白含有Motif 5，有5個轉錄因子蛋白含有Motif 6，有5個轉錄因子蛋白含有Motif 7，10個轉錄因子蛋白含有Motif 8，僅有4個轉錄因子包含Motif 9，5個轉錄因子包含Motif 10。

利用clustal W對所有的藜蘆bHLH結構域進行多序列比對，然后采用WebLogo 3作圖（圖3），藜蘆的bHLH結構域由53個氨基酸組成，包含2個不同的功能區域其N端的Basic區該區域氨基酸數量較少（13個氨基酸），第10、11位的精氨酸高度保守，堿性區域是轉錄因子的DNA結合區域，其作用可能是識別DNA的順式作用位點，該序列對靶基因啟動子上游的E-box識別結合必不可少；在C端的HLH區域第21、49位的亮氨酸保守度很高，第39、43位的亮氨酸、異亮氨酸也非常保守，這些氨基酸殘基對于二聚體的形成和功能非常重要。

圖2 MEME預測的藜蘆bHLH 10個Motifs Logo

圖3 藜蘆bHLH轉錄因子家族的保守結構域

圖4 藜蘆bHLH轉錄因子保守基序分布

3.4 藜蘆bHLH轉錄因子蛋白家族系統進化分析

使用MEGA 7.0軟件對72個藜蘆bHLH轉錄因子和部分擬南芥bHLH轉錄因子蛋白進行建樹（圖5）。經比對發現，bHLH轉錄因子和同源性較近的擬南芥bHLH序列交錯分布。依據擬南芥bHLH蛋白家族分類[23]，藜蘆bHLH蛋白被分為6個大族，分別為Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ和Ⅻ。其中Ⅲ族包含12個成員，Ⅳ族包含9個成員、Ⅶ族包含9個成員，Ⅷ族包含5個成員，Ⅸ族包含6個成員，Ⅻ族最多，含有31個成員，共計72個。根據進化樹分類結果，可將Ⅲ組與Ⅳ組細分為Ⅲb、Ⅲd、Ⅲe、Ⅳa、Ⅳb和Ⅳc幾個亞族，分別含有3、6、3、3、5和1個成員。幾乎所有藜蘆bHLH蛋白都與擬南芥bHLH蛋白聚在相同亞組上，同一亞族的藜蘆bHLH蛋白與擬南芥bHLH蛋白具有較高的相似性，藜蘆bHLH蛋白與相近的擬南芥bHLH蛋白可能具有相同或相似的功能。

圖5 藜蘆與擬南芥bHLH系統發育分析

3.5 不同組織藜蘆bHLH表達模式分析

對藜蘆bHLH轉錄因子基因在藜蘆轉錄組數據上的表達模式進行分析發現，72個基因在根、莖和葉3個不同組織中表達模式有差異（圖6），大部分bHLH轉錄因子都參與表達，少部分未表達或部分表達：5條bHLH（Vn_20080、Vn_14687、Vn_8116、Vn_40032、Vn_43577）在根中未達；2條bHLH（Vn_54312、Vn_14037）在根中表達較高，而在葉中表達量極低，結合藜蘆內的生物堿集中在根部，推測其可能參與了藜蘆植物根部某些生物堿的合成；還有些基因未參與表達，如Vn_79078。Vn_78073、Vn_83368 2條基因在莖中表達量明顯高于根部和葉片，可能在莖的發育過程中起重要作用；Vn_20800、Vn_14687和Vn_8116在葉片中表達顯著，可能參與葉的生長發育調控。此外一些bHLH（如Vn_53654、Vn_23633等）在藜蘆3個不同組織部位均有較高表達，說明其可能參與藜蘆整個生長發育周期中多種生理生化轉變的轉錄調控。總體上看，藜蘆bHLH的基因表達具有多樣性，一些基因能夠在某一或多種組織中發揮特定作用。

圖6 不同組織中藜蘆bHLH基因表達模式

4 討論

目前對基因家族的鑒定分析普遍使用基因組或基因組與轉錄組結合的方式，但藜蘆基因組尚未被報導，本實驗通過二代轉錄組測序完成轉錄本定量分析，使用全長轉錄組測序獲得一致性轉錄本。在此基礎上完成了對bHLH轉錄因子基因家族的模型篩選、結構預測和表達分析。在沒有參考基因組的情況下，二代、全長轉錄組聯合測序可作為替代策略進行基因挖掘[24]，完成對基因家族的鑒定及部分分析。轉錄組測序停留在組織表達層面，缺少對基因的結構及染色體定位、對蛋白及代謝物的調控也需要代謝組學提供幫助。因此，對基因的完整鑒定及功能挖掘需要基因組、轉錄組及代謝組的聯合分析來完成。

bHLH是真核生物中一類廣泛存在且數量眾多的轉錄因子，因具有螺旋-環-螺旋結構而得名，其通過特定的氨基酸殘基與靶基因結合來調節相關基因的表達[25]。與其他植物相比，藜蘆屬植物由于含有特殊的甾體類生物堿，成為該方向的研究熱點。SlbHLH114參與了番茄甾體生物堿的合成，可被甾體生物堿合成關鍵調控因子SlMYC2激活，從而顯著提高番茄內甾體生物堿代謝途徑基因的表達[26-27]。Vn_39017、Vn_53654和Vn_74175 3個基因與SlbHLH114、SlMYC2關系較近，在根中表達較高，且與甾體生物堿的聚集部位吻合，可能參與了藜蘆甾體生物堿環靶明的生物合成。植物bHLH轉錄因子參與各種信號轉導及合成代謝途徑的調控，如光信號轉導、激素合成、腺毛和根毛發育及逆境脅迫及枝條分枝等[28-30]，而且越來越多的研究表明bHLH轉錄因子對調節植物逆境具有重要作用。在擬南芥中，AtbHLH122對干旱、鹽脅迫和滲透脅迫具有正向調控作用[31]，此外，bHLH115可參與調節鐵的穩態[32]。根據與其他已驗證功能的bHLH基因建樹結果，可初步推測藜bHLH在信號轉導或代謝途徑調控中發揮的作用。

bHLH在不同組織部位的表達模式預示著bHLH蛋白功能的多樣性。煙草bHLH93具有明顯的組織特異表達[33]，在不同生長階段的側根和花期子房中有較高表達，這與植物甾醇合成的集中性特征相吻合；銀杏bHLH91的表達存在季節與組織性差異[34]。作為的靶基因，bHLH74能調控擬南芥根部的生長發育[35]。這些表達差異在72個藜蘆bHLH中也有體現，在根中表達量高或特異表達的bHLH對甾體生物堿的代謝可能具有調控作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Analysis ofbHLH transcription factor based on transcriptome

KOU Cheng-xi1, 2, TONG Jin-quan3, MA Rui4, SUN Wei5, XUE Zhe-yong1, 2, MA Peng-da3

1. Key Laboratory of Saline-alkali Vegetation Ecology Restoration Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China 2. Heilongjiang Key Laboratory of Plant Bioactive Substance Biosynthesis and Utilization, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China 3. College of Life Sciences, Northwest A&F University, Yangling 712100, China 4. Jilin Provincial Key Laboratory of Agricultural Biotechnology, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130033, China 5. Key Laboratory of Beijing for Identification and Safety Evaluation of Chinese Medicine, Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China

To identify and analyze the Veratrum () bHLH transcription factor gene family of Veratrum veratrum by bioinformatics based on transcriptome data.The bHLH gene was screened from the transcriptional sequence of Veratrum by hidden Markov model, and the physical and chemical properties and conserved motif of Veratrum bHLH were visually analyzed by online websites such as ExPASy and MEME and software such as MEGA and TBtools.A total of 72 bHLH transcription factors were identified in Veratrum transcriptome. The amino acid number of VnbHLH transcription factors was 105—692, the isoelectric point was 4.69—11.47, and the relative molecular weight was 11 071.2—77 795.3. Subcellular localization analysis showed that VnbHLH were all located in the nucleus. According to phylogenetic analysis, VnbHLH transcription factors were divided into six subgroups. The expression of VnbHLH was significantly different in different tissues, while Vn_54312 and Vn_14037 were highly expressed in roots. It is speculated that they may be involved in the synthesis of some alkaloids in the roots of Chenopodium.The analysis of bHLH transcription factor gene family inbased on transcriptome data is helpful to predict and verify the function of bHLH transcription factor family in..

L.; transcriptome; bHLH transcription factor; phylogenetic evolution; gene expression

R286.12

A

0253 - 2670(2022)14 - 4476 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.14.026

2021-12-02

吉林省農業科技創新工程項目（CXGC2017ZY029）

寇呈熹，碩士研究生，從事中藥活性物質代謝途徑解析。E-mail: 905546738@qq.com

薛哲勇，教授。E-mail: xuezhy@126.com

麻鵬達，副教授。E-mail: mapengda@163.com

[責任編輯 時圣明]