不明原因復發性流產蛻膜組織中血管內皮生長因子和雌孕激素受體的表達意義

溫勤堅 (深圳市寶安區中心醫院，廣東 深圳 518102)

復發性流產通常指的是連續自然流產次數≥3次的一種綜合征，其發病機制復雜，常與生殖系統解剖畸形、內分泌紊亂以及染色體異常等有關，還有一半患者無法查出病因，又被稱之為不明原因復發性流產(URSA)。近年來有文獻[1]報道，URSA的發生可能與孕激素受體(PR)和雌激素受體(ER)的表達異常有關，其中孕激素通過與PR的作用可以維持正常妊娠，而雌激素與ER相互作用能夠維持靶組織的生長和發育過程，若蛻膜組織中的PR和ER數量減少，則會對激素的生理功能產生直接影響。而血管內皮生長因子(VEGF)作為調節體內血管的一個中樞物質，對血管內皮細胞具有一定的特異性，不僅可以對滋養細胞的遷移和分裂起到促進作用，有助于形成新生血管，而血管生成是早期著床、胎盤形成以及妊娠成功所必需的。有研究[2]發現，與正常妊娠者相比，難免流產和習慣性流產患者的胎盤滋養細胞VEGF表達明顯較低。因此，本研究對URSA患者蛻膜組織中血管內皮生長因子和雌孕激素受體的表達意義進行了探討。

1 資料與方法

1.1一般資料：選擇我院收治的30例不明原因復發性流產孕婦為觀察組，再選擇同期的30例正常早孕人工流產孕婦為對照組，本研究經過本院醫學倫理委員會同意。對照組停經35～70 d，平均停經(52.4±9.3)d；年齡21～39歲，平均(29.5±8.5)歲。觀察組停經36～71 d，平均停經(52.5±9.4)d；年齡22～40歲，平均(29.7±8.6)歲。兩組的停經天數和年齡等資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。入選標準：①臨床資料完善，已明確臨床診斷；②平素月經正常，既往無甲狀腺功能異常及糖尿病病史；③無生殖器解剖學畸形；④流產絨毛行染色體核型分析未見異常；⑤無靜脈血栓史和肝腎疾??；⑥3個月內無激素補充治療病史。排除標準：①合并子宮肌瘤、多囊卵巢綜合征或子宮內膜異位癥者；②臨床資料缺失者；③中途退出研究者；④嚴重意識障礙或精神異常者。

1.2方法

1.2.1儀器：選擇奧林巴斯BX41顯微鏡、MICROM HMS760X染色機、塑料耐高溫染色架和染色缸、DHG-9075A電熱恒溫鼓風干燥箱、MICROM HM340E切片機以及石蠟急埋機。

1.2.2絨毛采集及檢測：兩組患者孕周相似，絨毛取自吸宮術時，在無菌生理鹽水中保存吸出的絨毛，在實驗室由專人對絨毛進行挑選，運用直接低滲的方法對染色體進行制備：G顯帶染色體，在顯微鏡下對10～20個分裂相細胞進行計數，對2～3個細胞核型進行分析，將胚胎染色體異常排除后，可測定蛻膜組織的激素受體。

1.2.3測定受體：人流術中同時無菌收集蛻膜2份，一份標本運用10%甲醛進行18～24 h固定后，常規石蠟包埋切片；另一份保存于-80℃冰箱中，將胚胎染色體異常排除后，測定蛻膜組織激素受體。同時，運用免疫組織化學方法對ER、PR的蛋白水平表達進行檢測，并且對VEGF水平進行檢測；逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測蛻膜組織中ER及PR的表達。

1.2.4RT-PCR檢測：0.9%生理鹽水將蛻膜組織沖洗干凈后，碾磨液氮至粉末后經過系列處理步驟使RNA提取步驟完成，并且去基因組、檢測純度、逆轉錄合成cDNA以及cDNA為模板進行PCR擴增。引物序列：ER(111 bp)：5'-GTCTGCCAGGTTGGTCAGTAAGC-3',PR(144 bp)：5'-GACCCTTTGCCTTCAGCT-CAGTC-3'。同時，擴增條件為：95 ℃ 15 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，共40個循環，并且運用2-△△Ct對目的基因相對含量(RQ)進行計算，即2-△△Ct=RQ。

1.3觀察指標：運用Sinierope改良判斷法，將染色細胞百分比和染色強度乘積得分作為基本依據，對受體表達情況進行分級，其中>5分為強陽性(+++)；4～5分為中度陽性(++)；2～3分為陽性(+)[3]。

2 結果

2.1兩組患者的VEGF水平比較：觀察組的+++和++所占比例低于對照組，且+所占比例高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組VEGF水平對比[n(%)，n=30]

2.2兩組免疫組化法檢測PR和ER的表達比較：與對照組比較，觀察組的ER表達陽性率低，組間對比差異有統計學意義(P<0.05)，兩組的PR表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組免疫組化檢測PR和ER比較(n，n=30)

2.3兩組RT-PCR方法檢測的PR和ER水平比較：觀察組的ER表達明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，但是兩組的PR表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組ER和PR水平比較

3 討論

通常情況下，雌孕激素水平維持正常能夠對子宮內膜容受性起到一定的促進作用，有助于植入胚泡和胎盤的形成發育，使胚胎處于正常生長發育狀態，尤其是子宮蛻膜上的PR和ER在維持妊娠中發揮著極其重要的作用[4-6]。在受精卵著床中，雌孕激素之間存在著密切的聯系，生理狀態下，雌激素啟動子宮內膜增值，誘導PR的產生，上調ER和PR。只有雌激素與相應的ER結合后，激素信號才可以向一系列細胞內的化學反應轉化，PR和孕激素的生理效應才可以得到充分發揮，所以ER表達差異也會對妊娠結局產生直接影響[7-8]。在本次研究中，經免疫組化和RT-PCR檢測，發現對照組的ER陽性率高于觀察組(P<0.05)，但兩組的PR陽性率比較差異無統計學意義(P>0.05)，說明子宮蛻膜組織缺乏雌激素受體表達是導致URSA的一個重要原因。有文獻報道[9]，將黃體功能不足誘發的流產排除后，若只給予患者單一孕激素補充，而雌激素水平不高的話，其保胎效果較差。因為雌激素水平低下胎盤組織作為雌激素的一個靶器官，其無法維持妊娠正常狀態，并且雌激素水平低下會抑制蛻膜組織中的PR生成，使孕激素表達的生理效應得不到有效發揮，從而誘發諸多不良事件如營養差、蛻膜發育不良、流產或者胚胎死亡等[10-11]。有學者在研究中發現，蛻膜組織中的雌激素受體含量低，則子宮內膜對激素的反應性就會下降，也就降低了子宮內膜對胚胎的接受性[12]。而升高雌激素和孕激素受體水平，則能使Th1/Th2型細胞因子保持平衡，從而維持正常妊娠[13]。反之，減弱其表達后會對細胞因子網絡產生破壞，使Th1和細胞因子偏離，對胚胎細胞的生長發育進行阻礙，從而誘發URSA[14]。

本次研究結果顯示，觀察組VEGF的+++和++所占比例低于對照組，且+所占比例高于對照組(P<0.05)?？梢酝茢?，VEGF在妊娠中起到一定的調節作用，VEGF表達不足，降低促血管內皮細胞遷移和增殖的能力，使與血管通透性相關的物質表達下調，絨毛血管生成出現缺陷，影響胎兒組織供血，誘發胎兒發育不良，從而導致早期自然流產[15]。

在本次研究中，觀察組的ER和VEGF水平均低于對照組。有文獻報道，ER對于妊娠維持有著十分重要的作用，雌激素通過與雌激素受體結合而導致目的基因表達，并且在多種組織中發揮其生理作用。有研究發現，在絨毛和蛻膜組織中均有ER表達，并且ER表達主要位于滋養細胞和蛻膜細胞胞核中，與本次研究報道一致。從本試驗中可以假設，蛻膜組織中的VEGF減少，可能導致ER的表達不足，使蛻膜血管形成障礙，蛻膜無法正常發育而導致著床失?。蝗舭l生于胚胎著床后，則會阻礙胚胎血供，從而導致胚胎死亡或流產，ER和VEGF可能存在相互調節的機制，為后續進一步的研究及治療提供了一個切入點。

綜上所述，雌激素受體表達偏低可能是不明原因復發性流產的原因之一，ER水平低使子宮內膜對激素的反應性降低，導致子宮內膜發育不良，對胚胎的容受性降低，故ER異常直接影響到激素作用的結果?？煽紤]在不明原因復發性流產患者的早期階段補充孕激素的同時，結合適量的戊酸雌二醇治療，可能提高ER及VEGF的表達，為胚胎提供好的子宮內膜環境，而改善臨床治療效果。此實驗結果，給臨床上單用孕激素治療效果不佳的患者在診療上提供了一個新的思路，具有重要的臨床研究意義。