miR-145與MyoCD調控VSMCs脂質蓄積的研究

龔勇珍，賀衛和，錢榮華，譚 峰，黃小龍 (.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 4008；.湖南中醫藥大學醫學院，湖南 長沙 4008)

動脈粥樣硬化(AS)是一種多因素引起的心腦血管疾病，脂質浸潤、慢性炎癥、血栓形成、內皮損傷、低密度脂蛋白氧化等因素均參與其中，最終導致血管壁硬化及AS斑塊形成[1-3]。泡沫細胞的產生是AS斑塊最為典型的病理變化，血管平滑肌細胞(VSMCs)和巨噬細胞是泡沫細胞主要來源，特別是AS斑塊中50%的泡沫細胞均來自VSMCs[4-5]，說明VSMCs在AS的發生發展過程中起著重要作用。心肌素(MyoCD)是一個強有力促心肌和VSMCs分化的轉錄共激活因子，在心肌細胞和VSMCs的發育過程中起著重要作用，而且敲除MyoCD會導致小鼠動脈夾層及動脈瘤形成[6]。miR-145定位于染色體5q32，在正常動脈及VSMCs中的表達量最高。研究發現miR-145對于VSMCs表型轉化具有顯著的調控作用，是VSMCs的表型調節器[7-8]。但通過調控miR-145表達是否影響VSMCs內脂質蓄積報道較少，因此本研究將探討MyoCD過表達載體聯合miR-145 inhibitor轉染探討對VSMCs脂質蓄積情況的影響。

1 資料與方法

1.1實驗細胞：人主動脈血管平滑肌細胞(HA-VSMCs)購于ATCC(CRL-1999)。

1.2實驗試劑與儀器：DMEM完全培養基(KGM12800S，凱基生物)；ox-LDL(S26774，源葉生物)； Trizol試劑、miRNA純化提取試劑盒、超純RNA提取試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(CWBIO 康為世紀，批號分別為CW0580S、CW0627S、CW0581M、CW0014S)；miRNA通用SYBR qPCR Master Mix、HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(諾唯贊，批號分別為MR101-02、R223-01);2×SYBR Green PCR Master Mix(A4004M，Lifeint 生命互聯)；RIPA細胞裂解液(C1053，北京普利萊基因技術有限公司)；超敏發光液(RJ239676，賽默飛)；鼠單克隆抗β-actin、辣根酶標記山羊抗鼠IgG(H+L)、辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(中杉金橋，批號分別為TA-09、ZB-2305、ZB-2301，1/2 000)；兔抗MyoCD (DF2434，Affinity，1/500)；總膽固醇(TC)測定試劑盒(A111-1-1，南京建成)；飽和油紅O染色液(G1260，Solarbio)；蘇木素染液(AR11800-1，BOSTER)。RT-6100酶標儀(Rayto)； CFX ConnectTM實時熒光PCR儀、Chemi DocTM XRS+超高靈敏度化學發光成像系統[伯樂生命醫學產品(上海)有限公司]；DYY-6C蛋白垂直電泳儀(北京市六一儀器廠)；BYC-310藥品冷藏柜(山東博科生物)；CX41顯微鏡(Olympus)。本研究經過本院醫學倫理委員會同意。

1.3實驗方法

1.3.1細胞實驗分組：①對照組，②MyoCD過表達空載組(NC組)，③MyoCD過表達組，④NC+miR-145 inhibitor組，⑤MyoCD過表達+miR-145 inhibitor組。

1.3.2慢病毒轉染MyoCD：當細胞密度達70%時，準備轉染；1 ml的細胞培養液里加入1 μl Polybrene助染劑，根據病毒滴度，按MOI為100加入相應的病毒量，37℃培養16 h，更換培養基繼續培養48 h。獲得MyoCD過表達空載組(NC)和MyoCD過表達組。

1.3.3脂質體轉染miR-145 siRNA：慢病毒轉染成功后，按照實驗分組進行抑制劑轉染。當細胞密度達70%時，用不含血清的培養基培養細胞；采用Opti-MEM稀釋Lipofectamine 3000及siRNA，二者混勻后室溫孵育15 min，轉染4 h，換成20%胎牛血清的培養基進行培養。獲得NC+miR-145 inhibitor組和MyoCD過表達+miR-145 inhibitor組。miR-145 inhibitor序列如下：5'-AGGGAUUCCUGGGAAAACUGGAC-3'。陰性對照：上游引物5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，下游引物5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。FAM陰性對照：上游引物5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，下游引物5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。

1.3.4Western印跡檢測轉染效果：BCA試劑盒測定標本蛋白濃度，并制定蛋白標準曲線。制作8%濃縮膠及12%分離膠。上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉電泳，濕法轉聚偏氟乙烯膜。2%BSA室溫封閉1 h，兔抗MyoCD、β-actin多克隆抗體4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L) 室溫孵育1 h，加入化學曝光液后，在凝膠成像系統中曝光，并根據Imag J軟件分析MyoCD、β-actin電泳條帶灰度值。

1.3.5熒光定量PCR檢測細胞基因表達水平：按照Trizol試劑盒提取RNA，紫外可見分光光度計測定mRNA濃度和純度，后根據HiFi Script cDNA 第一鏈合成試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，在熒光定量PCR儀上進行檢測，以GAPDH為內參，計算出各組miR-145-5p、ABCA1和MyoCD mRNA的相對表達量。各引物序列見表1。操作體系: RNase Free dH2O 9.5 μl、cDNA 1 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、2×qPCR混合物2.5 μl。反應程序，三步法：預變性：95℃、10 min，變性：95℃、10 s，退火：58℃、30 s，延伸：72℃、30 s，40個循環。融解曲線分析：95℃、15 s，58℃、1 min，95℃、15 s，58℃、15 s，58℃、15 s，95℃、15 s。

表1 各引物序列

1.3.6脂質蓄積：轉染成功后將細胞正常培養基換成含40 mg/L 的ox-LDL培養基孵育細胞，48 h后做油紅O染色，ELISA 檢測。

2 結果

2.1熒光PCR檢測MyoCD過表達載體的轉染效率及miR-145干擾效果：與對照組和空載組相比，miR-145-5p inhibitor組miR-145-5p表達明顯下降；與對照組相比，MyoCD過表達組MyoCD表達明顯升高，驗證通過。見圖1。

2.2Western印跡驗證MyoCD轉染效率：MyoCD過表達組與空載組相比，MyoCD表達顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)，可知過表達載體轉染有效，驗證通過。見圖2。

A～D：對照組、NC組、miR-145-5p inhibitor組

A～C:對照組、NC組、miR-145-5p組

2.3油紅O染色和ELISA檢測結果：如圖3A所示，為細胞油紅O染色結果。各組細胞在ox-LDL孵育48 h后進行染色，脂滴呈紅色，細胞核呈藍色，與對照組相比，實驗組細胞內脂滴數量較少，其中MyoCD+miR-145 inhibitor組細胞內脂滴數量最少。圖3B所示為ELISA檢測各組細胞內膽固醇含量，與對照組相比，其余三個組膽固醇含量明顯下降，其中MyoCD+miR-145 inhibitor組膽固醇含量最低，差異具有統計學意義(P<0.05)。

A～D：對照組、NC組、NC+miR-145 inhibitor組、MyoCD過表達+miR-145 inhibitor組

2.4熒光定量PCR檢測結果：與NC組相比，miR-145 inhibitor組和MyoCD過表達對ABCA1的水平無顯著影響。見圖4。

A～D：對照組、NC組、MyoCD+miR-145 inhibitor組、NC+miR-145 inhibitor組

3 討論

VSMCs及巨噬細胞是泡沫細胞形成的主要來源，脂質沉積是泡沫細胞形成的關鍵環節。血管脂質的沉積是AS發生的起始，脂質被氧化后沉積于內膜進而引起血管反應，導致VSMCs遷移及巨噬細胞浸潤，繼而吞噬大量的脂質。當細胞內蓄積了大量脂質后，泡沫細胞形成，加劇AS的進展[4-5]。因此學者認為通過防止VSMCs內脂質蓄積，可以抑制VSMCs源性泡沫細胞的形成。

2001年Wang等[9]采用BLAST數據搜索小鼠胚胎心臟cDNA文庫并克隆出了一個新的蛋白MyoCD，MyoCD基因位于第17號染色體p11.2區，片段長92 kb。MyoCD能夠廣泛地表達于心肌組織、收縮血管及平滑肌。研究表明MyoCD對于VSMCs增殖、分化及表型轉化具有顯著的調控作用，并與AS的發生發展密切相關[6,10]。miRNA是一類通過調控靶基因轉錄的非編碼RNA分子，是參與心腦血管疾病、腫瘤等多種疾病的重要調節分子[11]。miR-145定位于染色體5q32，在正常動脈血管及VSMCs中的表達量最高。研究發現miR-145對于VSMCs表型轉化具有顯著的調控作用，是VSMCs的表型調節器，能夠通過靶向調控KLF-4、KLF-5、血管緊張素轉換酶的表達，調節VSMCs收縮、分化及功能的恢復，而且增加miR-145表達會導致小鼠斑塊增加[12-13]。

本文首先通過PCR檢測了MyoCD過表達載體及miR-145 inhibitor轉染VSMCs，結果表明相較于對照組，MyoCD過表達組MyoCD mRNA表達量上調，miR-145 inhibitor組miR-145表達量下調，說明轉染成功。而且進一步采用Western印跡驗證了MyoCD過表達載體轉染的成功。接著探討二者聯合轉染對于VSMCs內脂質蓄積情況及膽固醇水平的影響，結果表明二者聯合能顯著的減少VSMCs內脂滴形成及膽固醇水平，從而說明MyoCD過表達聯合miR-145 inhibitor能顯著的抑制VSMCs內脂質蓄積，可能影響到AS的進展。

ABCA1是一種細胞膜結合蛋白，主要表達于VSMCs、巨噬細胞及內皮細胞，能夠通過介導VSMCs內游離膽固醇到到載脂蛋白上形成高密度脂蛋白，是膽固醇逆向轉運的第一步驟，因此能夠通過維持細胞內膽固醇平衡進而抑制VSMCs內泡沫細胞形成，緩解AS進展[14]。研究表明冠心病AS患者中ABCA1表達水平降低，且體內外實驗證實ABCA1減少是導致VSMCs脂質蓄積的重要原因[15]。通過上調ABCA1表達抑制VSMCs內脂質蓄積，進而可以抑制VSMCs源性泡沫細胞形成。因此本研究進一步探討MyoCD過表達聯合miR-145 inhibitor對于VSMCs中ABCA1表達量的影響，結果表明抑制miR-145對ABCA1 mRNA表達無影響。另外，miR-145 inhibitor + MyoCD過表達對ABCA1 mRNA表達無顯著影響，可能存在其他機制。

綜上所述，MyoCD過表達聯合miR-145 inhibitor能顯著抑制VSMCs內脂質蓄積。