養(yǎng)殖對(duì)蝦白斑綜合征防控技術(shù)研究進(jìn)展

謝 璽，王慶志

(遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，大連市海產(chǎn)貝類種質(zhì)資源創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

對(duì)蝦養(yǎng)殖是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要組成部分，中國(guó)已成為對(duì)蝦出口大國(guó)。近30年來(lái)，隨著養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，生態(tài)環(huán)境不斷惡化，對(duì)蝦的集約化養(yǎng)殖和管理不善導(dǎo)致了一些病毒性疾病普遍流行，主要病原包括：黃頭桿狀病毒(YHV)、桃拉綜合征病毒(TSV)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)、白斑綜合征病毒(WSSV)等，其中由白斑綜合征病毒引起的白斑綜合征對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的危害最為嚴(yán)重[1-2]。

對(duì)蝦白斑綜合征是由白斑綜合征病毒引起的暴發(fā)性流行病，白斑綜合征病毒可通過水平和垂直傳播感染中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)、日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeusjaponicus)、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)等幾乎所有對(duì)蝦類甲殼動(dòng)物，對(duì)蝦生命周期各階段全部易感，發(fā)病病程短，致死率極高[3]。感染白斑綜合征病毒后，對(duì)蝦甲殼內(nèi)表面初現(xiàn)點(diǎn)狀白斑，繼而逐漸擴(kuò)大至頭胸部和全身，最后甲殼呈白色；發(fā)病前期蝦須、尾扇發(fā)紅，身體消瘦，漫游于水面，發(fā)病后期病蝦殘胃或空胃，甲殼易脫離真皮，游動(dòng)緩慢無(wú)力，致死率高達(dá)100%[4]。

自20世紀(jì)90年代初，白斑綜合征病毒在中國(guó)臺(tái)北首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，先后在亞洲、北美洲、歐洲等國(guó)家和地區(qū)暴發(fā)，引起全球性對(duì)蝦流行病，造成養(yǎng)殖對(duì)蝦大規(guī)模死亡和巨大經(jīng)濟(jì)損失，成為全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)危害最大的一種病毒[5-7]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)、聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)以及亞太水產(chǎn)養(yǎng)殖網(wǎng)絡(luò)中心(NACA)將白斑綜合征列為需要上報(bào)的嚴(yán)重水生動(dòng)物病毒性疫病，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也于2009年將其列入《一、二、三類動(dòng)物疫病病種名錄》中水生生物一類動(dòng)物疫病。多年來(lái)，為了預(yù)防和控制該病害流行暴發(fā)，各國(guó)學(xué)者對(duì)白斑綜合征的病原學(xué)與流行病學(xué)、免疫與致病機(jī)理、生態(tài)防控與抗病育種等技術(shù)進(jìn)行了廣泛而深入的研究與應(yīng)用，取得了顯著成效，其中“中國(guó)明對(duì)蝦‘黃海1號(hào)’新品種及其健康養(yǎng)殖技術(shù)”與“對(duì)蝦白斑癥病毒單克隆抗體庫(kù)的構(gòu)建及應(yīng)用”兩項(xiàng)成果分別榮獲2007年度和2010年度國(guó)家技術(shù)發(fā)明獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)，為我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展提供了技術(shù)支撐。目前，在對(duì)蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)上多采用培育抗病力強(qiáng)的蝦種和切斷白斑綜合征病毒傳播途徑綜合防控白斑綜合征發(fā)生[8]。筆者以白斑綜合征防控技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀作為典型案例分析，展望相關(guān)技術(shù)的應(yīng)用前景，為有效防控對(duì)蝦白斑綜合征及其他病害提供參考。

1 白斑綜合征防控技術(shù)水平分析

白斑綜合征病毒是具有雙層囊膜的環(huán)狀雙鏈DNA病毒，基因組大小約為300 kb，不形成包涵體，病毒粒子形態(tài)為卵圓形或橢球形至短桿狀，呈規(guī)則對(duì)稱，長(zhǎng)度為250～380 nm，直徑為80～130 nm，囊膜厚為6～7 nm，一端具有鞭毛狀的延伸結(jié)構(gòu)(圖1[9])。病原體功能基因的研究已成為疫苗研制的一個(gè)方向。目前GenBank公布了白斑綜合征病毒中國(guó)株WSSV-CN、泰國(guó)株WSSV-TH、韓國(guó)株WSSV-KR、澳大利亞株WSSV-AU等10株的基因組序列[10-14]，各基因組序列間的差異主要表現(xiàn)在大序列缺失、單核苷酸突變、重復(fù)序列變化等方面。國(guó)際病毒學(xué)分類委員會(huì)(ICTV)將中國(guó)株系白斑綜合征病毒(Whitespotsyndromevirus)WSSV-CN列為線頭病毒科白斑病毒屬(Whispovirus)的代表種[15-16]。

圖1 白斑綜合征病毒病毒粒子的形態(tài)學(xué)Fig.1 Morphology of the WSSV virion

對(duì)白斑綜合征病毒的蛋白質(zhì)鑒定有助于認(rèn)知白斑綜合征病毒的裝配形式和入侵機(jī)理，為開發(fā)白斑綜合征病毒的快速診斷技術(shù)和疫苗提供理論依據(jù)。白斑綜合征病毒基因組中編碼的蛋白包括能組裝成病毒粒子的結(jié)構(gòu)蛋白和參與病毒復(fù)制及相關(guān)的調(diào)控蛋白。其中結(jié)構(gòu)蛋白可維持病毒基本構(gòu)象、保護(hù)病毒核酸，在病毒識(shí)別、吸附和侵入細(xì)胞過程中起重要作用[17]，主要為核衣殼蛋白(如VP15)、囊膜蛋白(如VP19與VP28)[18]和被膜蛋白(如VP26)(圖2[19])。

圖2 膜蛋白復(fù)合物和核衣殼的三維模型Fig.2 3D models of the membrane protein complex and the nucleocapsid

1.1 檢測(cè)與診斷技術(shù)

對(duì)蝦養(yǎng)殖實(shí)踐表明，任何病害一旦暴發(fā)就很難控制，易造成對(duì)蝦嚴(yán)重減產(chǎn)或絕產(chǎn)。在白斑綜合征病毒感染早期，快捷準(zhǔn)確的病毒診斷技術(shù)是生產(chǎn)上實(shí)現(xiàn)病毒預(yù)警與防控、減少經(jīng)濟(jì)損失的重要前提。目前，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(https:∥www.oie.int/index.php?id=2439&L=0&htmfile=chapitre_wsd.htm#chapitre_wsd.biblio-48)推薦的白斑綜合征病毒標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法主要包括宏觀病理學(xué)檢測(cè)法、顯微病理學(xué)檢測(cè)法[20-21]、抗體抗原檢測(cè)法[22-23]、分子生物學(xué)檢測(cè)法[24]等，一些方法的適用性和定向性診斷評(píng)級(jí)見表1。

表1 養(yǎng)殖對(duì)蝦不同階段定向監(jiān)測(cè)和診斷白斑綜合征病毒感染的方法評(píng)級(jí)

1.1.1 目視檢測(cè)法

目視檢測(cè)法主要依據(jù)宏觀病理學(xué)原理于養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)直接觀察判斷。一旦發(fā)現(xiàn)對(duì)蝦食量下降，靜臥水底，出現(xiàn)離群獨(dú)游、緩游、側(cè)游或游到水面附近等不正常的游泳行為，且甲殼上嵌有明顯的白色斑點(diǎn)，頭胸甲出現(xiàn)易剝離等癥狀[3,25]，建議及時(shí)采取應(yīng)急措施，控制病情蔓延。需要注意的是，出現(xiàn)白斑并非感染白斑綜合征病毒的可靠診斷標(biāo)志，也難以全面掌握白斑綜合征病毒的感染率，需結(jié)合組織病理學(xué)等方法獲得準(zhǔn)確病情。

1.1.2 顯微病理學(xué)檢測(cè)法

顯微病理學(xué)診斷法是通過光學(xué)或電子顯微鏡觀察患病對(duì)蝦的組織學(xué)變化，包括細(xì)胞核肥大、染色質(zhì)邊緣化等。黃倢等[26]首創(chuàng)了一種適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)白斑綜合征病毒的簡(jiǎn)便方法，即新鮮病變組織(如鰓上皮或表皮上皮組織)的T-E染色法，全程用時(shí)僅需10 min，通常在400～1000倍光學(xué)顯微鏡下可以看到細(xì)胞核肥大和核內(nèi)嗜酸性或空泡樣包涵體，不過該方法檢測(cè)到的病毒不能直接用于斷定對(duì)蝦發(fā)病。電子顯微技術(shù)可以直接觀察到白斑綜合征病毒粒子的形態(tài)和大小，是公認(rèn)最為直觀的檢測(cè)病毒性病原方法，但是操作復(fù)雜、樣品處理時(shí)間長(zhǎng)，試驗(yàn)條件比較嚴(yán)格[27-28]。

1.1.3 免疫學(xué)檢測(cè)方法

針對(duì)病毒或重組病毒結(jié)構(gòu)蛋白的多克隆和單克隆抗體已被用于各種免疫分析，包括免疫印跡分析[29]、酶聯(lián)免疫吸附法、液相芯片技術(shù)[30]等。其中酶聯(lián)免疫吸附法是根據(jù)免疫測(cè)定原理發(fā)展的一種固相免疫酶技術(shù)，包括單克隆抗體酶聯(lián)免疫吸附法[31]、間接酶聯(lián)免疫吸附法[32]、雙抗夾心直接或間接酶聯(lián)免疫吸附法[33]等，典型應(yīng)用代表是以膠體金免疫層析法為基礎(chǔ)建立的快速檢測(cè)試紙條，適用于對(duì)蝦養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)[34]。需要注意的是，白斑綜合征病毒的主要靶組織是外胚層和中胚層的胚胎起源，特別是角質(zhì)層上皮和皮下結(jié)締組織，但是不同組織對(duì)白斑綜合征病毒的免疫應(yīng)答有明顯差異，建議應(yīng)用該類方法時(shí)選擇蝦體相同部位檢測(cè)[35]。相較前述兩種方法，基于抗原抗體的方法更為快速方便，因此推薦該類方法用于確診急性白斑綜合征病毒感染。

1.1.4 分子生物學(xué)檢測(cè)法

分子生物學(xué)檢測(cè)法主要包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、隨即擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)、核酸探針技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)等。其中，PCR技術(shù)是以對(duì)蝦的基因組為模板，根據(jù)預(yù)測(cè)病毒設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè)，靈敏度高、特異性強(qiáng)，廣泛應(yīng)用于對(duì)蝦病毒的檢測(cè)、早期診斷、防控與品種選育等，目前國(guó)內(nèi)外均已開發(fā)出白斑綜合征病毒的商品化PCR檢測(cè)試劑盒[36-37]。一些研究人員還根據(jù)實(shí)際需要對(duì)常規(guī)PCR技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，使檢測(cè)結(jié)果更為快速準(zhǔn)確[38]，如套式PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR、多重引物PCR等[39-41]。核酸探針是被放射性同位素、生物素或熒光染料標(biāo)記了的能夠被探測(cè)到的核酸片段，具有特異性好、敏感性高和快速檢測(cè)等特點(diǎn)，白斑綜合征病毒核酸探針試劑盒目前已經(jīng)面世；通過結(jié)合原位雜交和組織切片技術(shù)，不但可以確定白斑綜合征病毒感染細(xì)胞的類型，而且能觀察到組織病理變化，相比染色更具優(yōu)越性，有助于研究發(fā)病機(jī)理和流行病學(xué)[42]。隨即擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)的擴(kuò)增產(chǎn)物能夠形成病毒核酸指紋圖譜，在檢測(cè)時(shí)可以比較不同來(lái)源毒株DNA序列的同源性，有助于篩選出與抗病性狀相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記[43]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)依賴于循環(huán)置換擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)對(duì)靶序列的放大，在等溫條件下，1 h即可擴(kuò)增出109拷貝靶序列，可以檢出對(duì)蝦發(fā)病早期或隱性感染階段體內(nèi)攜帶的較低量白斑綜合征病毒，兼具特異、靈敏和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)與推廣應(yīng)用等特點(diǎn)[44-45]。此外，近年來(lái)有國(guó)內(nèi)學(xué)者基于重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)技術(shù)初步構(gòu)建了對(duì)蝦白斑綜合征病毒快速檢測(cè)方法，在靈敏度(10個(gè)病毒粒子以下)和檢測(cè)時(shí)間(10 min以內(nèi))上體現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)，有望實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用與推廣[46]。

1.2 免疫防控技術(shù)

對(duì)蝦類水生動(dòng)物疾病的預(yù)防與控制是產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的關(guān)鍵和基本保障。對(duì)蝦養(yǎng)殖水環(huán)境復(fù)雜多變，病原變異頻繁，特別是大面積暴發(fā)的病毒性疾病很難得到有效的控制。免疫防治是對(duì)蝦大規(guī)模養(yǎng)殖中病害防控最有潛力的一種手段[18]。Venegas等[47]于2000年首次報(bào)道，在自然和試驗(yàn)白斑綜合征病毒感染中存活下來(lái)的日本囊對(duì)蝦對(duì)隨后的白斑綜合征病毒感染表現(xiàn)出了抗病性。經(jīng)典的免疫學(xué)理論認(rèn)為對(duì)蝦類無(wú)脊椎動(dòng)物的先天性免疫缺乏特異性和免疫記憶，盡管潛在的機(jī)制仍然未知，越來(lái)越多試驗(yàn)已經(jīng)表明，“接種”的對(duì)蝦在白斑綜合征病毒攻擊后有更好的存活率，說明在抵抗病原感染的過程中，對(duì)蝦的先天免疫系統(tǒng)同樣具有某種形式的免疫記憶，即所謂的“免疫啟動(dòng)”或“訓(xùn)練免疫”[48-49]。這種訓(xùn)練免疫記憶主要表現(xiàn)為：經(jīng)過病原微生物或疫苗的初次處理，多數(shù)對(duì)蝦[凡納濱對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)、日本囊對(duì)蝦等]可以對(duì)再次感染的同種或異種病原微生物誘發(fā)出更強(qiáng)的免疫防御反應(yīng)和清除病原的能力[19]。這種免疫反應(yīng)為通過接種疫苗制定對(duì)蝦類無(wú)脊椎動(dòng)物的疾病控制策略提供了理論基礎(chǔ)。目前，核酸疫苗(DNA疫苗和雙鏈RNA疫苗)被認(rèn)為是有效對(duì)抗白斑綜合征病毒的潛在新方法，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已研制出對(duì)蝦抗白斑綜合征病毒的核酸藥物或植物提取物等有效成分，可以誘發(fā)蝦體產(chǎn)生針對(duì)白斑綜合征病毒免疫應(yīng)答的保護(hù)效應(yīng)，提高對(duì)蝦成活率，相關(guān)產(chǎn)品已獲得國(guó)際專利授權(quán)[50-51]。

1.2.1 DNA疫苗

DNA疫苗一般由抗原蛋白基因和表達(dá)載體質(zhì)粒構(gòu)成，通過在宿主體內(nèi)翻譯、合成、識(shí)別過程激活免疫系統(tǒng)，當(dāng)病毒與宿主細(xì)胞表面分子相互作用時(shí)引發(fā)免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)，向?qū)ξr體內(nèi)導(dǎo)入利用編碼白斑綜合征病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP15、VP28、VP35和VP281的基因構(gòu)建重組DNA質(zhì)粒，能明顯提高對(duì)蝦的抗病力、存活率及酚氧化酶原和超氧化物歧化酶水平，抵御白斑綜合征病毒的侵害[52-53]。相比于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)疫苗：DNA疫苗制備簡(jiǎn)潔，成本低廉，易于規(guī)模化生產(chǎn)；抗原基因在體內(nèi)可以長(zhǎng)期表達(dá)；具有弱毒疫苗的免疫原性，能激發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，不存在毒力回升等[54]，但存在一定程度的轉(zhuǎn)基因爭(zhēng)議和風(fēng)險(xiǎn)。

1.2.2 RNA疫苗

RNA干擾是由雙鏈RNA(dsRNA)誘導(dǎo)的與dsRNA同源的mRNA高效特異性降解現(xiàn)象，能夠抑制相關(guān)基因表達(dá)，在水生動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗病毒入侵方面發(fā)揮重要作用[55-56]。白斑綜合征病毒是具有囊膜的雙鏈DNA病毒，利用RNA干擾技術(shù)可定向沉默編碼關(guān)鍵囊膜蛋白的mRNA來(lái)抑制白斑綜合征病毒的復(fù)制擴(kuò)增。研究發(fā)現(xiàn)，從脊椎動(dòng)物體內(nèi)獲得的免疫球蛋白基因dsRNA導(dǎo)入對(duì)蝦可以誘導(dǎo)其表現(xiàn)出白斑綜合征病毒抗性[57]。由于對(duì)蝦體內(nèi)不存在上述脊椎動(dòng)物的免疫球蛋白，所以脊椎動(dòng)物的dsRNA分子不會(huì)參與到對(duì)蝦的抗病毒免疫體系。這種抗病毒狀態(tài)的誘發(fā)是獨(dú)立于dsRNA序列的，引起染病對(duì)蝦死亡率降低的原因是注射到對(duì)蝦體內(nèi)的脊椎動(dòng)物免疫球蛋白基因dsRNA作為外源性物質(zhì)激活了對(duì)蝦先天性的免疫反應(yīng)[58]。白斑綜合征病毒的膜蛋白VP28或VP26的dsRNA注射免疫對(duì)蝦10 d后，對(duì)蝦累積死亡率均較低，其表現(xiàn)出較好的抗病毒保護(hù)效應(yīng)[59]。在中國(guó)明對(duì)蝦幼體中注射與白斑綜合征病毒蛋白激酶基因、VP28和VP281基因相關(guān)的長(zhǎng)鏈dsRNA能有效提高對(duì)蝦的存活率[60]。將VP28相關(guān)的短鏈dsRNA注射到對(duì)蝦體內(nèi)也具有類似效果，若干靶向病毒復(fù)制相關(guān)酶的小干擾RNA和短發(fā)夾RNA誘導(dǎo)的特異RNA干擾均不同程度地抑制了白斑綜合征病毒的增殖，降低了對(duì)蝦的死亡率[61]。

作為對(duì)抗病毒入侵的一種新技術(shù)，RNA干擾技術(shù)具有安全、高效、無(wú)毒等特點(diǎn)，在對(duì)蝦白斑綜合征病毒防治過程中將發(fā)揮積極作用。首先在技術(shù)層面上，可通過篩選不同靶點(diǎn)和不同劑量的dsRNA解決RNA干擾脫靶和劑量效應(yīng)問題；其次緣于RNA干擾的內(nèi)生性調(diào)控機(jī)制，導(dǎo)入對(duì)蝦體內(nèi)的dsRNA可以持續(xù)發(fā)揮作用。相比脊椎動(dòng)物，對(duì)蝦的dsRNA注射用量較少，生產(chǎn)成本更低。

2 白斑綜合征防控技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)

白斑綜合征的成功防控主要取決于流行病學(xué)的研究突破，查明傳染源、傳播途徑及暴發(fā)流行與環(huán)境的關(guān)系。早期是通過環(huán)境調(diào)控病原[62-63]，目前則是無(wú)特異性病原苗種生產(chǎn)技術(shù)和生物防控技術(shù)的融合，未來(lái)白斑綜合征等病害防控除了需要先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)，還可能依賴于疫苗技術(shù)、生態(tài)防控技術(shù)、無(wú)特異性病原苗種、生物絮團(tuán)環(huán)境調(diào)控技術(shù)的綜合應(yīng)用與發(fā)展。

2.1 免疫防控技術(shù)

疫苗是水產(chǎn)動(dòng)物疾病防控的最有效的手段，在對(duì)蝦類水產(chǎn)動(dòng)物病毒病防治上的不可替代性展現(xiàn)了它的應(yīng)用前景[64]。對(duì)蝦疫苗研制應(yīng)該符合疫苗學(xué)的發(fā)展方向，如研制能控制多種疾病的聯(lián)合疫苗、開發(fā)出治療性疫苗、通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備餌料食物疫苗等。飼料中添加免疫活性物質(zhì)，使對(duì)蝦在攝取食物的同時(shí)，調(diào)動(dòng)或激活自身的免疫系統(tǒng)，進(jìn)而增強(qiáng)抗病力。一些研究顯示，β-葡聚糖、維生素C、海藻提取物(褐藻多糖)和其他免疫增強(qiáng)劑可能提高對(duì)白斑綜合征病毒感染的抵抗力[65-66]，如：飼料中添加適宜的卵黃抗體能有效提高對(duì)蝦抗白斑綜合征病毒免疫因子的活性[67]；飼料中添加適量的家蠅抗菌肽能夠減少白斑綜合征病毒引發(fā)的對(duì)蝦血細(xì)胞和造血組織的程序性凋亡，提高對(duì)蝦的免疫力[68]；飼料中添加畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)的Fortilin蛋白，能提高對(duì)蝦的免疫力和感染白斑綜合征病毒后的存活率[69]；飼料中添加殼聚糖衍生物殼聚糖硫酸酯可以明顯提高對(duì)蝦抵御白斑綜合征病毒感染的能力[70]；在對(duì)蝦餌料中包裹可表達(dá)VP26融合蛋白的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)也能夠有效降低對(duì)蝦免受白斑綜合征病毒感染的概率[71]。

2.2 生態(tài)防控技術(shù)

生態(tài)防控是通過生態(tài)學(xué)手段調(diào)控養(yǎng)殖水體的理化因子和生物因子，如生態(tài)調(diào)控溶解氧、鹽度、溫度、密度、pH、氨氮、硝態(tài)氮等因子，阻斷病原體傳播途徑，達(dá)到預(yù)防疾病的目的。水體生物因子的控制主要是利用養(yǎng)殖生物間的互利或偏利作用實(shí)現(xiàn)的。我國(guó)現(xiàn)在流行將對(duì)蝦與大型海藻、濾食性貝類、肉食性魚類等進(jìn)行多營(yíng)養(yǎng)層次綜合養(yǎng)殖，通過改善水質(zhì)、提高對(duì)蝦抗病力、清除染病對(duì)蝦等途徑實(shí)現(xiàn)更高的養(yǎng)殖效益[72]。生產(chǎn)實(shí)踐表明，對(duì)蝦與河鲀混養(yǎng)的防病效果十分明顯，河鲀可以攝食感染白斑綜合征病毒游泳緩慢的對(duì)蝦，防止健康對(duì)蝦殘食病蝦而感染，客觀上起到防白斑綜合征病毒擴(kuò)散的效果[72]。同時(shí)應(yīng)注重調(diào)控浮游生物群落結(jié)構(gòu)，壓制藍(lán)藻的生態(tài)優(yōu)勢(shì)，避免藍(lán)藻等與白斑綜合征病毒的雙重脅迫，降低養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)。

此外，高密度對(duì)蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)中菌群結(jié)構(gòu)和多樣性對(duì)水質(zhì)和對(duì)蝦的生物安全都有很大影響。生物絮團(tuán)是在成熟的集約化養(yǎng)殖系統(tǒng)中，水體懸浮的細(xì)菌、殘餌、糞團(tuán)等顆粒有機(jī)物絮凝在一起自然形成的團(tuán)狀聚合物[73]。典型的生物絮團(tuán)以菌膠團(tuán)或絲狀細(xì)菌作為基架，通過附著細(xì)菌分泌胞外聚合物或靜電引力作用而結(jié)合。生物絮團(tuán)中含有多種有益微生物菌群及其分泌產(chǎn)物，如聚-β-羥基丁酸、多糖類等活性物質(zhì)，對(duì)養(yǎng)殖對(duì)蝦具有促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育和免疫增強(qiáng)作用[74]。基于生物絮團(tuán)技術(shù)構(gòu)建的零換水、高密度對(duì)蝦養(yǎng)殖模式，無(wú)需過濾、生物基反應(yīng)、消毒等復(fù)雜處理環(huán)節(jié)，即可直接分解轉(zhuǎn)化養(yǎng)殖動(dòng)物的代謝物及水體中的氨氮等有害物質(zhì)。生物絮團(tuán)中的微生物與病原菌發(fā)生空間與營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)，可以擾亂病原菌的密度感應(yīng)系統(tǒng)，從而抑制水體中病原菌生長(zhǎng)和繁殖[74]。因此，生物絮團(tuán)在對(duì)蝦病害防控中的關(guān)鍵是構(gòu)建封閉式生物絮團(tuán)養(yǎng)殖系統(tǒng)，避免引入外源性病原，提高養(yǎng)殖生物安全。

2.3 無(wú)特異性病原苗種生產(chǎn)及抗病種群選育技術(shù)

自白斑綜合征病毒暴發(fā)以來(lái)，對(duì)蝦育苗和養(yǎng)成率均較低，嚴(yán)重阻礙其養(yǎng)殖業(yè)的健康快速發(fā)展，因此在積極研制各種抗白斑綜合征病毒藥物的同時(shí)，引進(jìn)抗病力強(qiáng)的蝦種和開發(fā)對(duì)蝦無(wú)毒良種幼苗的培育技術(shù)尤為重要。無(wú)特異性病原蝦苗生產(chǎn)技術(shù)是通過建立家系選育無(wú)病毒親本，阻斷親本病毒的垂直傳播，保持選育親本優(yōu)良性狀的統(tǒng)一，最終獲得無(wú)特異性病原的苗種，從而遏制白斑綜合征病毒的危害。無(wú)特異性病原技術(shù)的應(yīng)用是控制病害發(fā)生的有效手段。我國(guó)是對(duì)蝦白斑綜合征的重災(zāi)區(qū)，得益于1999年引進(jìn)美國(guó)無(wú)特異性病原對(duì)蝦種蝦和繁育技術(shù)，培育出了無(wú)特異性病原蝦苗，我國(guó)對(duì)蝦產(chǎn)量也已從1994年低谷期的約6.0×104t恢復(fù)到2018年的1.409×106t。目前經(jīng)過系統(tǒng)人工選育的“黃海1號(hào)”中國(guó)對(duì)蝦與“中興1號(hào)”凡納濱對(duì)蝦已是通過全國(guó)水產(chǎn)原種和良種審定委員會(huì)審核的抗白斑綜合征病毒新品種。

3 應(yīng)用前景展望

3.1 加強(qiáng)病毒受體及其封閉劑的研究

病毒感染細(xì)胞的第一步是病毒與細(xì)胞膜表面的受體結(jié)合，無(wú)論是抗白斑綜合征病毒疫苗，還是抗白斑綜合征病毒多克隆抗體和噬菌體展示的單鏈抗體，針對(duì)的都是病毒感染相關(guān)囊膜蛋白[75]。因此，通過精準(zhǔn)定位并分離病毒受體，篩選出封閉病毒受體的高效藥物和方法，進(jìn)而阻斷二者結(jié)合，加強(qiáng)相關(guān)研究有助于預(yù)防和控制包括白斑綜合征在內(nèi)的對(duì)蝦病毒病。

3.2 加大疫苗給予途徑的研究

水產(chǎn)動(dòng)物疫苗可預(yù)防疫病發(fā)生，已成為病害防控領(lǐng)域研發(fā)的主流產(chǎn)品。在抗白斑綜合征病毒感染途徑的研究中，目前還沒有針對(duì)白斑綜合征病毒感染開發(fā)出持續(xù)有效的疫苗接種方法，通過注射、口服、浸浴方式或其中兩種方式相結(jié)合均能達(dá)到一定的抗病毒效果。注射方式需對(duì)個(gè)體逐一進(jìn)行，可推廣應(yīng)用于親蝦的抗病防治。浸浴和口服是目前對(duì)蝦疫苗給予途徑的重點(diǎn)研究方向。浸浴則較適用于苗期幼體，但是需要確定免疫原量、提高免疫效果和降低疫苗成本；口服是對(duì)蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)上較為理想的疫苗給予方式，如英國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖疫苗有限公司已開發(fā)出AquaVac抗弧菌口服疫苗和AquaVac ERM口服疫苗[64]，但有機(jī)體消化酶易削弱藥餌的抗病毒效果，因此需要開發(fā)可以封裝疫苗抗原而不損失疫苗效價(jià)的方法，如可作為蝦苗餌料的轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻口服劑具有較高的免疫保護(hù)效果且食藥同源[76-78]，有望應(yīng)用到對(duì)蝦口服疫苗的規(guī)模化生產(chǎn)中。

3.3 完善疫苗的評(píng)價(jià)系統(tǒng)

對(duì)蝦疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)不僅關(guān)系到疫苗的本身，而且是對(duì)蝦疫苗能否進(jìn)入商品流通領(lǐng)域的關(guān)鍵。評(píng)價(jià)系統(tǒng)應(yīng)兼顧疫苗的質(zhì)量和效果，包括疫苗安全性、免疫保護(hù)率、免疫學(xué)效應(yīng)、免疫學(xué)指標(biāo)及流行病學(xué)評(píng)價(jià)。

3.4 建設(shè)疫苗中試基地

中試基地是商品性對(duì)蝦疫苗應(yīng)市的重要橋梁，也是對(duì)蝦疫苗再研究的一個(gè)重要場(chǎng)地。目前，我國(guó)商品性對(duì)蝦疫苗遲遲未能應(yīng)市的原因之一就是缺乏中試基地。實(shí)驗(yàn)室所研究的疫苗能否真正阻止傳染性疾病的流行，需要中試基地的進(jìn)一步驗(yàn)證，從而實(shí)現(xiàn)疫苗產(chǎn)業(yè)化與規(guī)模化使用。

3.5 注重疫苗佐劑研發(fā)

疫苗佐劑是非特異性免疫增強(qiáng)劑，與疫苗抗原共同使用能增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答能力，具有增加抗原表面積、延長(zhǎng)抗原存留時(shí)間、增強(qiáng)細(xì)胞免疫活性、提高抗體水平等重要作用[79]。鑒于疫苗佐劑在水產(chǎn)動(dòng)物疫苗免疫過程中的重要作用，新型疫苗佐劑的開發(fā)和應(yīng)用可能是對(duì)蝦疫苗研究的重要方向，包括對(duì)蝦適宜佐劑的篩選、作用機(jī)理闡釋、產(chǎn)品開發(fā)與效果分析、安全性評(píng)價(jià)等。