急性鹽度脅迫對美洲鰣幼魚滲透調節的影響

郭 印，戴習林

(1.上海農林職業技術學院，上海 201600； 2.上海海洋大學，水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306； 3.上海海洋大學，農業農村部淡水水產種質資源重點實驗室，上海 201306；4.水產動物遺傳育種中心 上海市協同創新中心，上海 201306)

美洲鰣(Alosasapidissima)又名美洲西鯡，與中國的鰣(Tenualosareevesii)同屬鰣亞科，二者外部形態接近，美洲鰣具有較高的營養價值和經濟價值[1]，市場價格較高，養殖面積日益擴大[2]。鹽度是影響魚類正常生理活動與分布的重要環境因子，對魚類的生理生化、離子細胞大小和數量等指標有重要影響[3]。美洲鰣具有典型的溯河洄游特征[4]，對鹽度的適應性相對較強，親本培育中也常利用鹽度升降處理模擬美洲鰣的洄游生境[5]，然而在鹽度的急性脅迫下美洲鰣也會出現中毒癥狀[6]，掌握急性鹽度變化下美洲鰣的滲透壓調節方式，對人工養殖過程中控制適宜的鹽度具有重要的意義[7]。近年來，眾多學者研究了鹽度變化對不同魚類生理的影響以及魚類對鹽度的適應機制[8-16]，發現魚類血液滲透壓、Na+/K+-ATP酶活性、抗氧化酶活性等指標在研究魚類鹽度脅迫下滲透壓調節機制和生理變化的過程中具有重要的意義，然而目前對急性鹽度下美洲鰣的相關研究仍相對較少。筆者以幼魚階段的美洲鰣為研究對象，探討不同鹽度對美洲鰣幼魚的血清滲透壓、Na+/K+-ATP酶活性和過氧化氫酶活性的急性脅迫效應，以期為美洲鰣對鹽度突變的適應性研究提供理論依據，并為生產中通過進行鹽度調節從而調控美洲鰣的生長發育、提高存活率以及促進美洲鰣養殖產業的發展提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用美洲鰣幼魚購自上海申漕特種水產養殖公司，體長(6.3±0.3) cm，體質量(3.3±0.5) g。按60尾/m3分別置于500 L圓形塑料桶淡水中進行暫養，塑料桶內事先鋪設孔徑550～700 μm篩絹網，便于后期轉移試驗魚，使用散氣石不間斷充氣。試驗期間投喂浙江明輝牌海水魚配合飼料(粒徑1.8 mm，粗蛋白含量44%)，每日8：00和16：00各投喂1次，投飼率1%～2%，以1 h攝食完為準。暫養期間測得溶解氧7.63～7.89 mg/L，水溫29.0～32.2 ℃，每日18：00虹吸去除試驗桶底部雜質糞便。暫養15 d后，選取規格相近的健康個體進行試驗。

1.2 試驗方法

試驗容器為500 L圓形塑料桶，試驗用水由曝氣24 h后的自來水與海鹽按比例調配制成，試驗前用鹽度計(YSI30型)進行校準。有研究表明，美洲鰣仔魚24 h全致死鹽度(LC100)為30，96 h零致死鹽度(LC0)為20[6]，故本試驗設淡水為對照組，另設鹽度5、10、20試驗組，各組均設3個平行。每個平行投放試驗魚30尾，每組共計90尾。試驗開始時，各組水溫為(30±2) ℃、溶解氧為(7.5±0.3) mg/L、pH為7.6±0.4。用篩絹網將美洲鰣幼魚自淡水中取出，直接放入各鹽度組(含對照組)水體中。

試驗期間停止投喂，在0、6、12、24、48、96 h分別從每組中隨機挑取9尾(每個平行3尾)，使用10 mg/L丁香油麻醉，用1 cm3注射器心臟采血，每3尾魚所取血液作為1個測定樣本，混合后置于離心管分裝后靜置15 min，待血液分層后以 3500 r/min離心(離心半徑10 cm)5 min，所得血清用于滲透壓測定。抽血后快速將魚右側第二鰓弓上鰓絲取下，以4 ℃雙蒸水沖洗3次，去除污物，每3尾魚所取鰓絲混合作為1個樣本，置于5 mL無菌離心管中，轉移至超低溫冰箱內保存用于測定Na+/K+-ATP酶活性。取鰓絲后立即進行解剖并挑取肝臟組織，3尾魚肝臟混合后作為1個測定樣本，清洗后置于超低溫冰箱保存，用于過氧化氫酶活性的測定。

1.3 測定方法

1.3.1 血清滲透壓的測定

美洲鰣幼魚的血清滲透壓使用冰點滲透壓儀(Vapro5600型)測定，單位：1 mOsm/kg表示1 kg 溶劑中含1 mmol溶質。

1.3.2 鰓Na+/K+-ATP酶活性的測定

將鰓絲在勻漿介質(0.01 mol/L蔗糖，0.1 mmol/L EDTA-2Na，0.01 mol/L Tris-HCl，0.8% NaCl，pH 7.4)中剪碎，使用勻漿器(PRO250型)15 000 r/min制成勻漿，4 ℃下2500 r/min低溫離心(離心半徑10 cm)5 min后取上清液[16]，Na+/K+-ATP酶活性的測定與計算按照南京建成生物工程研究所生產的Na+/K+-ATP酶試劑盒說明書操作。

1.3.3 肝臟過氧化氫酶活性的測定

準確稱取肝臟組織質量，在勻漿介質(0.01 mol/L蔗糖，0.1 mmol/L EDTA-2Na，0.01 mol/L Tris-HCl，0.8% NaCl，pH 7.4)中剪碎，使用勻漿器(PRO250型)15 000 r/min制成勻漿，4 ℃下3000 r/min低溫離心(離心半徑10 cm)5 min后取上清液[17]，按照南京建成生物工程研究所生產的過氧化氫酶試劑盒說明書進行測定。

1.4 數據處理

試驗數據通過Excel 2019與SPSS 19.0統計軟件進行處理和分析，數據以平均值±標準差表示。利用方差分析檢驗鹽度對測定指標影響的顯著性，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 急性鹽度脅迫下美洲鰣幼魚的滲透壓變化

急性鹽度脅迫下美洲鰣幼魚血清滲透壓的變化情況見圖1。由圖1可見，鹽度處理對美洲鰣幼魚血清滲透壓有顯著影響(P<0.05)。從鹽度脅迫的時間過程來看，各鹽度組滲透壓隨時間的延長呈現先快速升高后逐漸降低的趨勢，其中鹽度20試驗組在6 h時達到最大值[(265.4±4.8) mOsm/kg]，而鹽度5試驗組、鹽度10試驗組在12 h時達到最大值[(262.3±2.8) mOsm/kg、(266.0±3.1) mOsm/kg]。24 h后鹽度5、10、20試驗組幼魚血清滲透壓隨時間變化呈下降趨勢并逐漸穩定。從各時間點比較4組不同鹽度處理的滲透壓變化，結果顯示，處理6 h時各試驗組幼魚血清滲透壓隨鹽度的升高均出現上升，12～96 h各時間點基本表現出鹽度高的處理組其滲透壓較高，且與對照組差異顯著(P<0.05)。鹽度5試驗組美洲鰣幼魚血清滲透壓在6、48 h時顯著低于鹽度20試驗組(P<0.05)。試驗結果表明：提高鹽度處理時，美洲鰣幼魚可以通過升高自身的滲透壓以適應外界的高鹽度環境；美洲鰣幼魚對鹽度的脅迫反應較強烈，鹽度差越大，其滲透壓的應激反應越快并越強烈，隨后會隨著時間的延長而逐漸下降，或趨于穩定。

2.2 急性鹽度脅迫下美洲鰣幼魚Na+/K+-ATP酶活性變化

鹽度處理對美洲鰣幼魚Na+/K+-ATP酶活性影響顯著(P<0.05)(圖2)。從鹽度脅迫的時間過程來看，6 h后各試驗組Na+/K+-ATP酶活性顯著下降，12～24 h各試驗組Na+/K+-ATP酶活性總體趨于平緩，48 h各試驗組Na+/K+-ATP酶活性總體呈上升趨勢，96 h鹽度5、10試驗組繼續上升，鹽度20試驗組出現下降。整個試驗過程中試驗組Na+/K+-ATP酶活性明顯低于對照組(P<0.05)。從各時間點比較4個不同鹽度處理的Na+/K+-ATP酶活性，結果顯示，6 h時鹽度10、20試驗組顯著低于鹽度5試驗組(P<0.05)，12～48 h各試驗組無顯著性差異，96 h時鹽度20試驗組顯著低于其他2個試驗組(P<0.05)。試驗結果表明，美洲鰣對急性鹽度的脅迫反應較強烈，Na+/K+-ATP酶活性出現了較大幅度下降，且鹽度差越小，其Na+/K+-ATP酶活性出現上升趨勢所用時間越短。

圖1 急性鹽度脅迫對美洲鰣幼魚血清滲透壓的影響Fig.1 Effect of acute salinity stress on serum osmotic pressure of juvenile American shad A. sapidissima相同時間不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同.Means with different letters at the same time are significant difference among treatments (P<0.05)，et sequentia.

圖2 急性鹽度脅迫對美洲鰣幼魚鰓絲Na+/K+-ATP酶活性的影響Fig.2 Effect of acute salinity stress on Na+/K+-ATP enzyme activity in gill filaments of juvenile American shad A. sapidissima

2.3 急性鹽度脅迫下美洲鰣幼魚過氧化氫酶活性變化

從鹽度脅迫的時間過程來看：鹽度5試驗組美洲鰣幼魚過氧化氫酶活性在6 h時升高，12～24 h維持相對穩定狀態；鹽度10試驗組酶活性在6 h時未出現明顯變化，12～24 h出現下降(圖3)；兩組至48 h均達到峰值，96 h出現下降；鹽度20試驗組幼魚酶活性在試驗期間持續下降。從各時間點看：6～12 h，鹽度5試驗組過氧化氫酶活性顯著高于其他組(P<0.05)，鹽度10試驗組6 h時與對照組無顯著差異，12 h時顯著低于對照組(P<0.05)；24～48 h時各鹽度組過氧化氫酶活性差異顯著(P<0.05)，24 h時酶活性依次為對照組>鹽度5試驗組>鹽度20試驗組>鹽度10試驗組，48 h時酶活性大小為鹽度5試驗組>鹽度10試驗組>對照組>鹽度20試驗組，鹽度20試驗組顯著低于其他組(P<0.05)；96 h時各試驗組過氧化氫酶活性均顯著低于對照組(P<0.05)，其中鹽度5試驗組顯著高于鹽度10、20試驗組(P<0.05)。試驗結果表明，急性鹽度脅迫對美洲鰣幼魚過氧化氫酶活性有較強的影響，表現為鹽度變化越大該酶活性越易受到抑制。

3 討 論

3.1 急性鹽度脅迫對美洲鰣幼魚血清滲透壓的影響

高鹽度環境下幼魚需消耗一定能量來維持體內滲透壓，直接影響攝入營養的分配和餌料利用率，會對魚類的生長產生影響[18-19]。魚類滲透壓調節主要通過腎臟、鰓等器官完成[20]，幼魚由淡水進入高鹽度環境，其血清滲透壓低于水體滲透壓，幼魚會大量吞飲鹽水同時攝入大量離子，這些離子通過腸道吸收進入血液，血清中離子濃度增高，滲透壓也隨之增高。在高滲環境中魚類的滲透壓調節主要通過大量飲水，鰓絲上的氯細胞排出大量的Na+，

圖3 急性鹽度脅迫對美洲鰣幼魚過氧化氫酶活性的影響Fig.3 Effect of acute salinity stress on catalase activity of juvenile American shad A. sapidissima

腎臟排出部分離子與極少量的水分來維持體內的低滲透壓[11,14]。魚類對鹽度的適應過程分兩個階段：一是鹽度升高或降低后，短期內魚類血清滲透壓迅速變化的階段；二是滲透壓逐漸恢復穩定的階段[21]。在本試驗中，美洲鰣幼魚的滲透調節在鹽度5、10、20環境中明顯升高，24 h前為幼魚對鹽度變化的適應階段。有研究表明，硬骨魚類血清滲透壓會隨鹽度呈正相關的變化[11]。本試驗中，各試驗組美洲鰣幼魚血清滲透壓隨鹽度升高也相應升高，并出現波動變化，24 h后，各處理組美洲鰣幼魚血清滲透壓穩定在246.0～255.3 mOsm/kg，并隨著時間推移緩慢降低。96 h時各鹽度組血清滲透壓均有恢復正常的趨勢，與施兆鴻等[16]結論一致。說明美洲鰣幼魚在一定范圍內的鹽度突變下，可以通過自身滲透壓調節去適應環境變化，并表現為鹽度差越大，其滲透壓的應激反應越強烈，隨后會隨著時間的延長逐漸趨于穩定，對鹽度有較強的適應能力。

3.2 急性鹽度脅迫對美洲鰣幼魚Na+/K+-ATP酶活性的影響

鰓是魚類進行滲透調節和離子運輸的主要器官，鰓上皮氯細胞中含有大量Na+/K+-ATP酶，該酶是魚體氯細胞與外界離子轉運的關鍵酶，也是廣鹽性魚類參與滲透調節的一項重要指標[22]。Na+/K+-ATP酶在環境鹽度發生變化時，魚類鰓絲Na+/K+-ATP酶活性會升高或降低，這是鰓對體內外Na+和Cl-等離子運輸需要的適應機制[23-25]。

廣鹽性魚類的Na+/K+-ATP酶活性一般隨鹽度變化呈“U”型變化，在等滲點附近Na+/K+-ATP酶活性最低[9]。本試驗結果表明，24 h內試驗組美洲鰣幼魚鰓絲Na+/K+-ATP酶活性均隨鹽度的升高而降低，在24 h時酶活性達到最低，鹽度5試驗組、鹽度10試驗組幼魚鰓絲Na+/K+-ATP酶活性48、96 h持續上升，總體呈“U”型分布，并表現為鹽度差越小，酶活性出現上升趨勢所用時間越短。鹽度20試驗組幼魚的Na+/K+-ATP酶活性在48 h上升，96 h下降，未呈現“U”型變化，說明鹽度20的急性變化對幼魚的滲透調節脅迫要大于低鹽度環境[13]。由于鰓絲Na+/K+-ATP酶不是魚類滲透壓調節的唯一要素，故本試驗中鹽度20試驗組酶活性上升受阻，可能與鹽度脅迫下美洲鰣幼魚需要時間去啟動其他調節機制有關，具體機理待進一步研究。

3.3 急性鹽度脅迫對美洲鰣幼魚過氧化氫酶活性的影響

過氧化氫酶在魚體清除脅迫過程中產生的活性氧自由基環節中起重要作用[19,26]，過氧化氫酶能防止代謝及超氧化物歧化酶轉化過程中產生的過氧化氫對機體造成傷害，以抵御鹽脅迫，防止生理應激[27]。當鹽度發生變化時，魚類必然要經歷滲透調節等一系列過程[28]，需要消耗大量能量，加速體內新陳代謝，引發體內抗氧化酶的響應，以應對自由基對機體的脅迫。有學者研究發現，大菱鲆(Scophthalmusmaximus)幼魚[29]、條石鯛(Oplegnathusfasciatus)幼魚[30]、施氏鱘(Acipenserschrenckii)[12]在不同鹽度脅迫下體內過氧化氫酶活性均會發生適應性變化，來消除鹽度突變下產生的多余自由基以維持機體的正常功能。本試驗中，鹽度5試驗組、鹽度10試驗組的過氧化氫酶活性變化趨勢一致，其變化幅度與鹽度有著密切的關系，表現為先升后降，說明急性鹽度的脅迫對幼魚酶活性有較強的影響，其中鹽度5試驗組過氧化氫酶活性響應時間較鹽度10試驗組快，表明美洲鰣較為適應鹽度5的環境變化。鹽度10試驗組酶活性響應慢的原因可能為鹽度脅迫導致美洲鰣幼體內產生并堆積較多活性氧自由基，過氧化氫酶活性需要一定時間誘導緩慢升高來減少自由基對細胞的傷害[31]，這與譚春明等[32]研究結果較為一致。有研究表明，魚類在過高鹽度脅迫下會生成大量活性氧，過量的活性氧在體內往往表現為毒性分子，易導致機體受氧化脅迫，引起細胞氧化損傷，從而破壞生理機能[33-35]。本試驗中，鹽度20試驗組過氧化氫酶活性長時間顯著低于對照組，鹽度變化越大該酶活性越易受到抑制，可能在鹽度20的急性脅迫下，幼魚未能較好地適應環境，體內氧自由基不斷積累，抗氧化酶的活性不足以抑制細胞內的氧化損傷，導致清除自由基的能力下降，從而使抗氧化酶活性降低[36]。

4 結 論

試驗結果表明，美洲鰣幼魚對鹽度適應能力較強，可以通過機體的一系列生理調節，較好地適應鹽度5及鹽度10的急性脅迫。人工養殖馴化過程中應控制水體鹽度突變在10以下，且鹽度變化幅度越小美洲鰣可越快適應水體環境。