創(chuàng)傷性顱腦損傷患者血清M-sec蛋白的表達與認知功能障礙的相關性研究

馮九庚，鄒樹峰,陳偉,2

（1.南昌大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，南昌 330006；2.上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 201299）

創(chuàng)傷性顱腦損傷（Traumatic Brain Injury,TBI）的發(fā)病率逐年增長[1]，因神經(jīng)元功能缺失所致的功能障礙改變嚴重影響著患者的生存質量[2]。近年來，納米樣隧道管（Tunneling Nanotubes,TnTs）已經(jīng)成為細胞間研究的熱點之一。盡管目前對于TnTs的形成尚不完全明確，有研究顯示哺乳動物的腫瘤壞死因子-α誘導因子2（Tumor Necrosis Factor-alpha Induced Protein2,TNFAIP2，又名Msec）蛋白為TnTs形成過程中不可或缺的蛋白[3-4]，并受腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factoralpha,TNF-α)調節(jié)，因此我們推測M-sec蛋白可以作為TnTs形成的標記蛋白。本文對TBI患者進行回顧性研究，收集TBI患者268例，動態(tài)檢測傷后血清TNF-α、M-sec蛋白含量的變化，傷后6個月采用蒙特利爾認知評估量表（Montreal cognitive assessment,MoCA）評價患者有無認知功能障礙，并比較多時間節(jié)點血清M-sec蛋白含量與MoCA評分的相關性。

1 研究對象

1.1研究組選入標準 明確的TBI病史，TBI后24小時內(nèi)入院；年齡16~65歲；均受過小學以上程度教育；病情穩(wěn)定，在急性期內(nèi)可耐受腰穿，后期可進行認知功能的測定。排除標準：既往有嚴重的TBI病史及其它顱內(nèi)疾病史；受傷前有反復腦卒中及癡呆表現(xiàn)；合并其它嚴重的多臟器損傷；既往有垂體和甲狀腺疾病、嚴重肝衰竭、糖尿病、惡性腫瘤等全身性疾病史；嚴重失語和意識障礙；死亡及失訪病例。共納入研究268例，男性181例，女性87例；年齡18~65歲，平均年齡（41.82±11.22）歲；初中文化程度78例，高中文化程度103例，大學及以上文化程度87例；受傷方式：車禍傷141例，打擊傷23例，墜落傷88例，跌傷12例；格拉斯哥昏迷評分（Glasgow Coma Score,GCS）3~8分27例，9~12分51例，13~15分190例。同時分別在三個醫(yī)院共選取100例常規(guī)體檢成年患者作為對照，且MoCA評分在正常范圍內(nèi)，其中男性70例，女性30例，年齡在18~65歲，平均年齡（40.38±10.66）歲；初中文化程度28例，高中文化程度38例，大學及以上文化程度34例。本研究經(jīng)過病人或其家屬的知情同意并自愿參加，上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院、南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院及南昌大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審查同意。兩組年齡、性別和文化程度比較無明顯差異（P>0.05）,具有可比性。

1.2認知功能的評估 本組患者在TBI后6個月由經(jīng)過正規(guī)培訓的神經(jīng)外科及創(chuàng)傷中心醫(yī)師對其進行認知功能的測試。測試時間為北京時間下午14:00，最長時限為30分鐘。選用MoCA量表來評估患者認知功能，總分為30分，得分>26分提示存在認知功能障礙。比較認知功能障礙與無認知功能障礙患者的差異。

1.3 TNF-a、M-sec測定方法 研究組于傷后第1、3、5、7、14天清晨采集空腹血4 mL，4000 r/min×10 min，取上清液，-20℃保存待用。采用化學發(fā)光法分別測定血清TNF-α和M-sec含量，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），嚴格按照各自試劑盒（博士德生物，中國）的操作說明進行操作，酶標儀（TECAN，奧地利）在450 nm波長下測度吸光度值，通過標準曲線計算血清TNF-α、M-sec蛋白濃度，對照組早晨空腹采集靜脈血4 mL，同上方法保存和測定，分析血清TNF-α、M-sec蛋白動態(tài)變化與認知功能障礙的相關性。

1.4統(tǒng)計學分析 應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，進行分析計量資料用(±s)表示，組間比較有采用設計兩樣本均數(shù)t檢驗，對有認知功能障礙患者與無認知功能障礙患者比較采用Mann-Whitney U檢驗。TBI后個時間點血清M-sec蛋白與MoCA意義評分采用Pearson相關性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TBI后認知功能障礙情況 根據(jù)MoCA量表評估，研究組傷后6個月存在認知功能障礙108例，（40.29%），認知功能障礙病人在視空間與執(zhí)行、注意力與計算、語言能力、抽象能力及延遲記憶等方面差異明顯（P<0.05）,而在命名和定向力方面無顯著差異(P>0.05)，見表1。

2.2 TBI后血清TNF-α、M-sec蛋白動態(tài)變化TNF-α和M-sec蛋白在正常對照組組含量分別為(0.56±0.11)ng/mL和(54.25±8.66)ng/mL。TBI患者血清TNF-α和M-sec蛋白含量在TBI后隨著患者有無認知功能障礙而表達呈不同趨勢，在無認知功能障礙患者中，TBI后第1天TNF-α、M-sec表達明顯較對照組升高（P<0.05），且在傷后7 d內(nèi)都維持在較高水平（P<0.05），在傷后14 d降低至與正常對照組無明顯差異。而在TBI后有認知功能障礙組表現(xiàn)則不同，TNF-α、M-sec表達在傷后第1天則明顯降低，與正常組及無認知功能障礙組差異明顯（P<0.05），并在傷后第3天TNF-α、M-sec蛋白含量均降至最低水平，并與無認知功能障礙組差異明顯（P<0.05），TBI后第5、7天兩者的表達明顯回升，甚至明顯高于正常組（P<0.05），并與無認知功能障礙組無明顯差異（P>0.05），在傷后14天，有認知功能障礙組的兩者蛋白水平恢復到與無認知功能障礙組、正常對照組均無明顯差異（P>0.05），見表2，3。

2.3 TBI患者血清M-sec動態(tài)變化與認知功能障礙的相關性分析 將患者傷后6個月的MoCA評分與各時間點血清M-sec含量進行Pearson相關性分析發(fā)現(xiàn)，傷后第3天血清M-sec表達與MoCA評分相關性最為明顯（P<0.05），而傷后第5天Msec含量與MoCA評分則無明顯的相關性（P>0.05）。說明TBI患者急性期血清M-sec含量有助于預測患者傷后有無認知功能障礙的發(fā)生，而且在傷后第3天的血清M-sec值與認知功能相關系數(shù)最大，說明傷后第3天血清M-sec蛋白含量最能反應認知功能的預后，見表4。

表1 有無認知功能障礙TBI患者Mo CA量表各認知領域評分比較

3 討論

TBI后的神經(jīng)元的治療是一個世界范圍內(nèi)的難點、熱點。星形膠質細胞（Astrocyte）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的細胞類型，除了支持、營養(yǎng)神經(jīng)元外，還參與調控神經(jīng)元的功能[5]。我們近期的研究結果顯示，星形膠質細胞可能通過緩解神經(jīng)元的鈣超載從而產(chǎn)生保護作用[6]，但此過程的具體機制并不完全明確。我們前期針對于在星形膠質細胞中高表達的縫隙連接蛋白阿爾法1（GJA1）蛋白進行了深入的研究，并已證明非磷酸化的GJA1蛋白在星形膠質細胞對神經(jīng)元的保護中起著極為重要的作用[7-8]，由于神經(jīng)元的數(shù)量遠遠少于星形膠質細胞，單純的相鄰星形膠質細胞—神經(jīng)元間GJA1的數(shù)量及功能不足以維持星形膠質細胞對神經(jīng)元的保護作用。因此，我們推測其它的細胞間直接連接方式在腦損傷后星形膠質細胞對神經(jīng)元的保護中可能起著更為重要的作用。目前，在這方面與TBI的相關的研究較少。

15年前，細胞間的TnTs通道被首次提及,其直徑多在50~1000 nm,而長度一般在數(shù)微米到數(shù)百微米，可供較大分子量的物質通過（>1.2kD）[9-10]。M-sec最初被稱為TNF-α誘導因子2，其功能尚不完全明確[11]。有研究顯示，M-sec可誘導細胞膜的F-肌動蛋白（F-actin）形成凸起，進而延展形成TNTs通道[12]，因此M-sec蛋白亦被稱為TnTs的標志蛋白[13]。當前與TNTs有關損傷后保護的研究也日漸增多，但目前多集中在與干細胞有關的損傷后修復方面[14-15]，且目前國內(nèi)外在此領域的研究目前僅局限在體外實驗中，尚未涉及到體內(nèi)及臨床領域。因此我們推測，星形膠質細胞在TBI后與通過TnTs對神經(jīng)元起著更為廣泛的保護作用。基于該設想，我們通過本實驗發(fā)現(xiàn)，TBI后有認知功能障礙的患者在TBI后第1天血清TNF-α、M-sec蛋白表達明顯低于正常對照組，而在傷后3天降至最低，盡管其在傷后第5天明顯回升至與無認知功能障礙組無明顯差異，但仍無法逆轉神經(jīng)元及其功能的損傷所致的認知功能障礙。而有趣的是，在TBI后無認知功能障礙患者血清TNF-a、Msec蛋白的表達則出現(xiàn)應激性升高，并且在7天內(nèi)維持在一個相對較高的水平。針對于此現(xiàn)象分析，我們認為原因為（1）神經(jīng)元及神經(jīng)功能的損傷呈現(xiàn)不可逆性，尤其在急性期內(nèi)，如缺乏神經(jīng)元保護，則神經(jīng)元及神經(jīng)功能損傷則進一步明顯、（2）無認知功能障礙患者在TBI后，顱內(nèi)TNF-α等炎性代謝產(chǎn)物增多，TNF-α誘導M-sec表達升高，以誘導星形膠質細胞建立更多的與神經(jīng)元的TnTs通道,以保護神經(jīng)元功能。同時大量產(chǎn)生的M-sec蛋白則通過受損的腦血屏障進入血液，導致血清中M-sec表達增高、（3）在有認知功能障礙的患者中，TNF-α表達升高延遲，導致在急性期內(nèi)誘導的M-sec蛋白表達降低，星形膠質細胞對神經(jīng)元保護性的TnTs構建減少，損傷保護性效應減弱，神經(jīng)元及神經(jīng)功能損傷相對明顯。

本研究中將患者TBI后6個月的MoCA量表評分與各時間點的M-sec蛋白含量進行Pearson相關性分析發(fā)現(xiàn)，在TBI后1、3天（急性期）M-sec蛋白含量與MoCA評分正相關，而在亞急性期內(nèi)，M-sec蛋白含量則與MoCA評分無明顯相關性。這說明TBI急性期的血清M-sec蛋白含量的檢測可能有助于預測TBI患者傷后有無認知功能障礙發(fā)生，傷后第3天血清M-sec與MoCA相關系數(shù)R值最大，說明傷后第3天血清M-sec與認知功能的預后相關性最大。

表2 TBI患者血清TNF-α含量的變化（ng/mL）

表3 TBI患者血清M-s e c含量的變化（ng/mL）

表4 TBI患者血清M-s e c含量與Mo CA評分的Pe a rs on相關性分析

綜上所述，TBI患者在急性期內(nèi)的M-sec蛋白含量的降低與認知功能障礙的發(fā)生的相關性較大。對急性期內(nèi)的M-sec蛋白含量進行動態(tài)監(jiān)測，可能有助于了解星形膠質細胞對神經(jīng)元的直接保護及隨后的神經(jīng)功能的保護的作用、早期預測TBI后神經(jīng)元、神經(jīng)功能損傷及評估認知功能障礙的程度及預后。不足之處在于，本研究病例數(shù)仍偏小，今后需進一步擴大臨床樣本，為TBI后神經(jīng)元、神經(jīng)功能的保護及認知功能障礙的預防、治療提供潛在的靶點。