不同劑量朱砂對睡眠剝奪前后大鼠的GABA和血汞的影響

陳銘奇 黃俊山 曾雪愛 王秀峰 張瑜

(福建省中醫藥科學院，福建省中醫睡眠醫學重點實驗室，黃俊山福建省名老中醫藥專家傳承工作室，福州，350003)

隨著對冬奧冠軍谷愛凌的報道，10 h睡眠成了大眾關注的熱點。近年來由于社會的快速發展，工作節奏越來越快，再加上疫情給大眾生活和工作帶來的壓力，越來越多的人正受到睡眠剝奪(Sleep Deprivation，SD)的威脅。睡眠剝奪是指各種原因所致的睡眠減少或睡眠時間嚴重不足，主要與睡眠時間和睡眠類型異常明確相關，包括完全睡眠剝奪、長期睡眠受限及睡眠片段化[1]。睡眠是人體消除疲勞，維持注意力和認知能力的重要途徑[2]。睡眠受多種神經遞質調節，包括興奮性神經遞質如多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)、5-羥色胺(5-HT)及抑制性神經遞質如γ-氨基丁酸(GABA)。現代研究表明GABA是中樞神經系統中重要的抑制性遞質，產生鎮靜催眠作用[3]。朱砂作為傳統中藥有良好的安神定志、清心解毒的功效，使其在中醫臨床治療失眠的過程中具有不可替代的地位。而對朱砂毒性的認識經歷了《神農本草經》時的“無毒”到明清時代的“有毒”，再到當今的“限量”使用。硫化汞是朱砂的主要成分，硫化汞存在β和α 2種晶形，紅色的α型硫化汞微粒粒徑約為6～10 μm，性質穩定，是朱砂中硫化汞的主要晶形，在體內可發生酸效應和絡合效應[4]。目前關于朱砂鎮靜安神的研究多集中在毒性研究和一次性服藥后的藥時曲線，對于朱砂發揮重鎮安神作用是否通過GABA進行調節，以及連續多日服用外周血汞濃度變化方面的研究較少。綜上所述，本研究將對不同劑量的朱砂對睡眠剝奪大鼠γ-氨基丁酸(GABA)的調節作用以及連續7 d的治療期內外周血汞的代謝曲線進行觀察，為臨床更好應用朱砂提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雄性(Sprague-Dawley，SD)大鼠，SPF級，體質量(260±20)g，50只，由上海斯萊實驗動物有限公司提供，飼養于福建省中醫藥科學院動物實驗室，實驗室溫度控制在20～25 ℃，濕度在50%～60%，12 h:12 h固定照明節律，普通維持飼料喂養，自由進食飲水。大鼠購入后適應性飼養3 d后開始實驗。

1.1.2 藥物 朱砂(亳州市京皖中藥飲片廠，水飛炮制品)，根據歷版朱砂用量，本項目將朱砂劑量分為3種：0.1 g作為Ⅰ低劑量組的用量，0.5 g作為Ⅱ中劑量組的用量，1.5 g作為Ⅲ高劑量組的用量，大鼠用量為成人6倍(按體質量計算)。

1.1.3 試劑與儀器 大鼠GABA ELISA試劑盒(上海酶聯生物研究所)。大鼠腦立體定位儀(美國Stoelting公司)、BP211D電子天平(德國Sartarius)、超純水系統(美國MilliPoreTGL-16B)、高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)、改良多平臺水環境睡眠剝奪裝置、MA-3000汞分析儀；酶標儀(美國BioTek，800TS)。

1.2 方法

1.2.1 睡眠剝奪大鼠模型復制 改良多平臺水環境法進行睡眠剝奪大鼠造模。在直徑80 cm的水箱內放高6 cm，直徑3 cm的圓形小平臺12個，每個平臺間隔15 cm，箱內注水后水面低于平臺1 cm，水箱頂部用鐵絲網蓋住，大鼠可自由進食、飲水、活動，進入睡眠時由于骨骼肌的松弛會掉入水中驚醒造成睡眠剝奪。每日換水添食，室溫保持在23～25 ℃，并給予每天24 h擬光照環境。

1.2.2 實驗動物分組和給藥 將睡眠剝奪成功的50只大鼠隨機分為3組：空白組10只、模型組10只、朱砂高、中、低劑量觀察組各10只。根據《中華人民共和國藥典》2015年版，本項目將朱砂劑量分為3種：0.1 g作為低劑量觀察組的用量，0.5 g作為中劑量觀察組的用量，1.5 g作為高劑量觀察組的用量，大鼠用量為成人6倍(按體質量計算)。采用隨機法分3個劑量組，用散劑混合蒸餾水灌胃。各組均按15 mL/kg體質量灌胃，每天09:00灌胃1次，共7天。模型組：10只，用蒸餾水灌胃。

1.2.3 采樣 本實驗采用微透析技術將透析探針埋入動物的腦中，透析探針可除去分子量大于30 000的分子，對周圍組織損傷很小，取樣量少，對實驗動物的生存率有所保障。雄性SD大鼠以水合氯醛(400 mg/kg)腹腔麻醉，固定在立體定位儀上，將透析套管定位于右側紋狀體(前囟前0.2 mm，旁開3.5 mm，皮層下5.2 mm)并用小螺釘固定。開啟透析灌流系統，調節恒流泵控制液流速30 μL/min，透析探針與人工腦脊液灌流系統直接相接。灌流平衡120 min后，每15 min收集1管，每管30 μL，共收集3管透析液。收集的透析液立即放入-20 ℃冰箱保存。

1.2.4 實驗及指標的觀察

1.2.4.1 給藥前后各組一般狀況 觀察睡眠剝奪7 d后及朱砂治療7 d后各組大鼠的毛色光澤，精神情緒，體質量變化等情況。

1.2.4.2 ELISA檢測腦脊液和血液中GABA含量 給藥結束后第2天，各組大鼠麻醉后眼眶采血及腦脊液微透析，每只獨立分裝在凍存管，-20 ℃冰箱貯存待檢。隨后根據ELISA說明書檢測GABA含量。

1.2.4.3 EPA7473熱分解齊化原子吸收光度法檢測連續7 d血汞含量 給藥開始后第2天起，每天上午09:00對高、中、低劑量組大鼠進行眼眶采血，離心保存在-80 ℃冰箱待檢。然后根據EPA7473熱分解法進行汞原子檢測。

2 結果

2.1 給藥后各組一般情況 空白組大鼠精神活潑、活動規律；模型組出現明顯失眠特征，表現為白天夜晚活動頻繁、睡眠減少、精神疲憊，對外界聲光刺激異常敏感、情緒易激、攻擊性強，且皮毛失去光澤毛流散亂，體形消瘦、體質量明顯減輕。觀察組一般行為狀態較模型組有所改善，精神較好、活動較規律。與空白組比較，模型組、低劑量觀察組、水觀察組大鼠體質量顯著性降低(P<0.01)；與模型組比較，高、中劑量觀察組大鼠體質量均有明顯增加(P<0.01)；與水觀察組比較，高、中、低劑量觀察組體質量有明顯增加(P<0.05)。見圖1。

圖1 不同觀察組大鼠的體質量比較

2.2 外周血中GABA含量變化 與空白組比較，模型組和不同劑量朱砂觀察組的大鼠血液中GABA含量未見明顯變化(P>0.05)。

2.3 腦脊液中GABA含量變化 與空白組比較，模型組、高、中、低劑量觀察組和水觀察組大鼠腦脊液中GABA的含量顯著減少(P<0.01)；與模型組比較，空白組、高、中、低劑量觀察組和水觀察組大鼠腦脊液中的GABA含量不同(P<0.01)；與水觀察組比較，高劑量觀察組的大鼠腦脊液有明顯差異(P<0.01)。見圖2。

圖2 不同觀察組大鼠腦脊液中GABA含量比較

2.4 觀察組外周血中汞含量變化 觀察組在連續服用不同劑量朱砂5 d內血汞濃度總體呈上升趨勢，以高劑量組最明顯，低劑量組次之，中劑量組最慢(P<0.01)。到第7天后血汞濃度總體有下降趨勢，高劑量組的大鼠血汞含量較中、低劑量組顯著升高(P<0.01)。見圖3。

圖3 觀察組連續7 d的血汞含量變化曲線

3 討論

本研究發現，睡眠剝奪對大鼠的情緒狀態和體質量的改變是非常明顯的并且難以自行恢復，這與朱寅秋的研究結果相符[5]。有研究發現，急性睡眠剝奪與睡眠抑制均會使個體變得更易怒[6]，產生更多抑郁焦慮的消極情緒[7]。盡管經過朱砂的治療情緒障礙和體質量能夠改善，但相比睡眠剝奪給身體和情緒造成的傷害其治療作用還是相對比較有限的。根據《2020年中國人睡眠質量報告》顯示近3億中國人睡眠質量差，近67.24%的人出現失眠癥狀。經歷了疫情后，中國人入睡時間延遲了2～3 h。這是一個非常嚴重的問題，并且需要立即得到關注與干預。睡眠剝奪包含了各種自發的和被動造成的睡眠缺失狀態。長期的睡眠剝奪不僅造成機體生長發育的不良、情緒心理障礙，同時也可能是年輕人猝死的一個重要因素。

本研究發現，睡眠剝奪能夠使大鼠腦脊液中GABA含量顯著降低，并且在后期也較難自行恢復，可見睡眠剝奪對大腦的損傷是顯著的、不可逆的。而高劑量的朱砂治療能夠使腦脊液中GABA含量有較明顯的改善，但作用有限。這與以往實驗研究報道結果相符[8]。γ-氨基丁酸(GABA)作為腦內主要的抑制性神經遞質，是由L-谷氨酸在谷氨酸脫羧酶(GAD)作用下脫羧形成，對中樞神經元有普遍抑制和調節作用[9]。另外本研究發現，睡眠剝奪對大鼠外周血中GABA含量的改變無顯著差異。已有研究發現除了神經系統外，GABA還廣泛分布于脂肪、肝臟、肌肉等外周組織[10]。這可能與外周組織的調控有關，外周血中的GABA含量能夠受到外周組織調控而保持相對穩定。

本研究發現，中、低劑量朱砂對腦脊液中GABA含量不能起到明顯的調節作用；只有高劑量朱砂能夠較明顯促進腦脊液中GABA生成；但連續7 d朱砂治療顯示的高劑量朱砂能夠使外周血中汞含量明顯高于中、低劑量組。這可能說明了GABA并不是朱砂改善睡眠的主要作用靶點。現代研究發現[11-13]朱砂除對GABA有影響外，朱砂還可降低其他興奮性神經遞質如5-HT、NE、天冬氨酸、甘氨酸含量。王旗等[14]通過小鼠高架水迷宮試驗證實了朱砂有抗焦慮作用。測定小鼠腦內單胺類神經遞質及其代謝產物發現，朱砂對5-HT有劑量依賴性抑制作用，但對DA和NE無明顯影響。

朱砂作為中醫重鎮安神藥中的典型代表，以其“色赤通心，重能鎮怯，寒能勝熱，甘以生津，抑陰火之浮游，以養上焦之元氣，為安神之第一品。”現代臨床研究也證實了朱砂及其復方在鎮靜催眠、抗焦慮、抗恐懼、外用消炎等具有良好療效，但在臨床口服多以復方配伍使用，單味藥口服較少即使低劑量口服也不能保證其安全性，其發揮作用的主要靶點在腦組織中，其濃度與安全劑量、蓄積代謝的藥代動力學還有待進一步驗證，其解毒方面的研究將是后面的主要研究方向。