建蘭紅草紅荷的組織培養(yǎng)研究

袁匯明 侯曉杰 梁魁景 于占晶 謝李晏 劉佳倍 劉宇沖

（衡水學(xué)院 河北 衡水 053000）

蘭花作為“四君子”之一，自古便深受人們的喜愛與追捧，孔子稱譽(yù)它為“王者之香”，并言“芝蘭生于幽谷，不以無人而不香”[1]；“扈江離與辟芷兮，紉秋蘭以為佩”，屈原以蘭為友，以蘭為飾，以表達(dá)其高尚品德和崇高理想；王羲之練字借鑒蘭花，將蘭葉的各種姿態(tài)運(yùn)用到書法中，使他的書法結(jié)構(gòu)、筆法、章法的技巧達(dá)到精熟的高度[2]。

中國(guó)傳統(tǒng)名花中的蘭花僅指分布在中國(guó)植物中的若干種地生蘭，如春蘭、惠蘭、建蘭、墨蘭和寒蘭等[3]。建蘭葉片寬窄適合，蔥翠飄逸，在眾多蘭花中屬嬌媚型。建蘭品種較多，根據(jù)建蘭的花型和顏色來判斷其珍貴程度：蘭花的花型以荷瓣最為珍貴，其次是梅瓣或者水仙瓣等一些奇花；花色以純一色及淡綠者為好，深綠者次之，瓣、唇有紅絲紅點(diǎn)者更次，初開時(shí)為紅色而后轉(zhuǎn)為綠色者又次之；葉色以油潤(rùn)光澤者為好。

建蘭紅草紅荷為被子植物門微子目蘭科蘭屬植物，是建蘭“金荷”與“紅草”的人工雜交品種[4]，紅草紅荷是它的品種的一個(gè)總稱，因?yàn)樗l(fā)出來的芽呈紅色，苗子在成苗前也會(huì)呈紅色，因此稱為紅草，瓣型為荷瓣且為粉紅色，即為紅荷，故稱紅草紅荷。紅草紅荷既是荷瓣且花色是難得的紅色，發(fā)紅芽，觀賞性極強(qiáng)，是集藝草、紅花以及荷瓣于一體的佳品，十分具有觀賞價(jià)值和科學(xué)研究?jī)r(jià)值，市場(chǎng)前景廣闊。紅草紅荷是為人們所觀賞把玩的網(wǎng)紅產(chǎn)品，但在成株后紅色葉片變?yōu)榫G色，觀賞價(jià)值有所降低。為探索其變色原因，我們展開了系列試驗(yàn)研究。

組織培養(yǎng)指用植物各部分組織進(jìn)行培養(yǎng)從而獲得再生植株[5]。本試驗(yàn)通過用建蘭紅草紅荷的葉片、根尖、假鱗莖等作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)[6]，研究各個(gè)器官的組織培養(yǎng)效果，選擇效果好的進(jìn)行大量繁殖并商業(yè)運(yùn)作。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器設(shè)備

1.1.1 試劑。無菌水、MS 培養(yǎng)基、95%酒精、75%酒精、1%次氯酸鈉、30%過氧化氫等。

1.1.2 儀器設(shè)備。移液槍及槍頭、電子天平、容量瓶、超凈工作臺(tái)、光照培養(yǎng)箱、加熱套、pH 控制儀、高溫滅菌鍋、冰箱等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 母液的配制。①10 倍母液Ⅰ(大量元素)：分別稱量硝酸16.5 g、硝酸鉀19 g、二水氯化鈣4.4 g、硫酸鎂3.7 g、磷酸二氫鉀1.7 g。②200 倍母液Ⅱ(微量元素)：分別稱量碘化鉀0.166 g、硫酸錳4.46 g、硫酸鋅1.72 g、鉬酸鈉0.05 g、硫酸銅0.05 g、氯化鈷0.05 g、硼酸1.24 g。③200 倍母液Ⅲ(鐵鹽)：分別稱量四乙酸二鈉7.46 g、5.56 g。④母液Ⅳ(有機(jī))：200 倍有機(jī)母液A 的配制，依次稱量煙酸0.1g、鹽酸硫胺素0.02g、鹽酸吡哆素0.1 g；200 倍有機(jī)母液B 的配制，稱量肌醇5 g；200 倍有機(jī)母液C 的配制，稱量甘氨酸0.4 g。以上母液稱量后均取少量蒸餾水進(jìn)行溶解，將溶解完畢的液體依次注入1 L 的容量瓶中加蒸餾水定容，做好標(biāo)記，于4 ℃冰箱冷藏儲(chǔ)存。

1.2.2 植物激素的配制。①0.1 mg/ml 6-BA 溶液：稱量25 mg 的6-芐氨基腺嘌呤，用少量1 mol/L 的鹽酸溶液溶解后，再加入蒸餾水倒入250 ml 的三角瓶中定容至250 ml 并做好標(biāo)記。②0.1 mg/ml NAA 溶液：稱量25 mg 的萘乙酸，用熱水溶解后，再加入蒸餾水倒入250 ml 的三角瓶中定容至250 ml 并做好標(biāo)記。③0.1mg/ml 2,4 -D溶液：稱量20 mg 的2,4-二氯苯氧乙酸，用少量95%酒精溶解后，加入蒸餾水倒入200 ml 的三角瓶中定容至200 ml 并做好標(biāo)記[7]。

1.2.3 1/2MS 培養(yǎng)基的配制。分別量取母液Ⅰ50 ml、母液Ⅱ2.5 ml、母液Ⅲ2.5 ml、有機(jī)母液A 2.5 ml、有機(jī)母液B 2.5 ml、有機(jī)母液C 2.5 ml、0.1 mg/ml 6-BA溶液30 ml、0.1 mg/ml NAA 溶液20 ml、0.1 mg/ml 2,4-D 溶液10 ml，取大燒杯1 只，將所有的溶液依次加入其中備用。稱量瓊脂粉10 g、蔗糖30 g 備用。用搪瓷杯量取600 ml 蒸餾水在電磁爐上加熱，倒入瓊脂粉與蔗糖攪拌使其充分溶解[8]。將溶解好的瓊脂粉蔗糖溶液倒入裝有母液的大燒杯中充分混合，用蒸餾水定容至1 L 并調(diào)節(jié)pH 值至6.0。趁熱將培養(yǎng)基分裝至組培瓶中用封口膜封住，再放置在高溫滅菌鍋中121 ℃滅菌15 min，冷卻凝固后即得到所需的培養(yǎng)基。

1.2.4 外植體的獲取。選取紅草紅荷的紅色幼葉、綠色成熟葉、鱗莖芽、根尖分別裝入紗布中包好，置于流水下沖洗2 h，在已滅過菌的超凈工作臺(tái)中用濃度為75%的酒精浸泡2 min，后用無菌水沖洗3 次，再用1%的次氯酸鈉溶液浸泡10 min，最后用無菌水沖洗5 次，即可獲得所需的外植體[9]。

1.2.5 接種。組培室紫外燈滅菌2 h，超凈工作臺(tái)滅菌2 h，工作臺(tái)用酒精擦拭1 遍，用鑷子與手術(shù)剪剪取葉片1 cm2、鱗莖芽、根尖等插入培養(yǎng)基中，接種完畢后及時(shí)封口[10]。

1.2.6 光照培養(yǎng)箱中靜置觀察。設(shè)定光照培養(yǎng)箱為25℃±2 ℃全日光照模式，將接種好的組培苗放入觀察。

2 結(jié)果與分析

從表1 可以看出，以建蘭紅草紅荷組織培養(yǎng)的多組處理，以紅色葉片(幼葉)為外植體的12 組(每組中有3～5 小片)處理，分3 批經(jīng)過30 d 的連續(xù)觀察，30 d時(shí)成活率為75.00%；以綠色葉片(成熟葉)為外植體的12 組(每組中有3～5 小片)處理，分3 批經(jīng)過30 d 的連續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)30 d 時(shí)成活率為50.00%；以鱗莖芽為外植體的12 組處理，分3 批經(jīng)30 d 的連續(xù)觀察，30 d 時(shí)成活率達(dá)83.33%；以根尖(水晶根)為外植體的12 組處理，分3 批經(jīng)30 d 的連續(xù)觀察，30 d 時(shí)的成活率僅為16.67%。

表1 建蘭紅草紅荷外植體各部位各時(shí)間段組培成活率 (單位： %)

3 結(jié)論與討論

在以建蘭紅草紅荷葉片、根尖、鱗莖芽等作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)的各處理中，鱗莖芽處理優(yōu)于葉片，葉片處理優(yōu)于根尖處理，紅色幼葉誘導(dǎo)成功率高于綠色成熟葉。究其原因是因?yàn)檫^小的外植體不易存活，而且分裂增殖的部位少；而過大的外植體污染率高、容易褐化死亡[11]。

蘭科植物通過組織培養(yǎng)能夠在短期內(nèi)獲得大量幼小植株，是現(xiàn)階段最經(jīng)濟(jì)有效的快速繁殖方法，也是工廠化育苗的重要途徑之一[12]。但目前我國(guó)蘭花還尚未真正實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)的地步，可能是因?yàn)榻M培技術(shù)快繁的試管苗在移栽后生長(zhǎng)慢、試管苗易變異、根狀莖增殖速度慢、芽分化率低等主要問題尚未得到突破，尤其是用莖尖誘導(dǎo)形成的根狀莖初期的增殖速度更緩慢，嚴(yán)重阻礙了組培快繁技術(shù)在國(guó)蘭種苗生產(chǎn)中的應(yīng)用[13]。建蘭紅草紅荷作為時(shí)代新品，相信在科學(xué)技術(shù)的不斷完善下，一定可以使其大量繁育，并進(jìn)一步打開市場(chǎng)，將科技福利送入千家萬戶。