基于JNK/AMPK-mTOR 調(diào)控Bcl-XL 對(duì)急性髓系白血病細(xì)胞化療敏感度的干預(yù)作用

郭艷榮 金麗虹 林佩佩 段玉波

1.臺(tái)州市中心醫(yī)院（臺(tái)州學(xué)院附屬醫(yī)院）血液內(nèi)科，浙江臺(tái)州 318000；2.浙江省臺(tái)州醫(yī)院小兒外科，浙江臺(tái)州 317000；3.江西省腫瘤醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，江西南昌 330000

造血系統(tǒng)的惡性疾病是急性髓系白血病，造血細(xì)胞增殖失控、凋亡受阻、分化障礙是其特征。在不同類型的細(xì)胞中，Jun 氨基末端激酶（JNK）可促凋亡效應(yīng)、傳遞抗凋亡信號(hào)、激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）是一種應(yīng)激反應(yīng)酶，AMP/ATP 比例升高時(shí)影響細(xì)胞的生物學(xué)行為是因?yàn)锳MPK 激活促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、自噬、凋亡等生理過(guò)程，mTOR 在能量充足時(shí)激活、缺乏時(shí)抑制。最近有文獻(xiàn)報(bào)道，B 淋巴細(xì)胞瘤XL 蛋白（Bcl-XL）表達(dá)的高低與癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感度密切相關(guān)。因此，本研究基于JNK/AMPK-mTOR 調(diào)控Bcl-XL 對(duì)急性髓系白血病細(xì)胞化療敏感度的干預(yù)作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究細(xì)胞

白血病HL-60 細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院上海生物研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 白血病HL-60 細(xì)胞株復(fù)蘇，以完全培養(yǎng)液：含體積分?jǐn)?shù)為0.20 的滅活胎牛血清（上海語(yǔ)純生物科技有限公司）、置40℃、體積分?jǐn)?shù)7% CO的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔日換液，存活細(xì)胞百分率（臺(tái)盼藍(lán)拒染法）＞90%。

1.2.2 分組和轉(zhuǎn)染 急性髓系白血病組（100 nmol/L+脂質(zhì)體）、陰性對(duì)照組（不做任何處理）、下調(diào)Bcl-XL 組（100 nmol/L inhibitor+脂質(zhì)體），按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的說(shuō)明書將上述各組細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)6 h，更換成完全培養(yǎng)基，在常規(guī)條件下繼續(xù)培養(yǎng)，待培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 檢測(cè)Bcl-XL 采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色，取單層細(xì)胞片，在純丙酮中固定25 min。放在甲醇溶液孵育20 min，除去過(guò)氧化物酶。滴加正常細(xì)胞，封閉10 min，去余液。滴加Bcl-XL 抗體，過(guò)夜。PBS 共洗5 min×10次。滴加生物素化Bcl-XL 抗體，孵育。滴加SABC 試劑，孵育。

1.2.4 細(xì)胞增殖能力 三組取HL-60 細(xì)胞，制成濃度為120 個(gè)／ml 的細(xì)胞懸液，以每孔120 μl 接種于83孔細(xì)胞板上。加入25 μl／孔MTT 試劑孵育。棄上清后，加入120 μl 二甲基亞楓震蕩反應(yīng)使結(jié)晶紫溶解充分。設(shè)定酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為430 nm，檢測(cè)各組細(xì)胞的光密度（OD）值，并記錄。

1.2.5 細(xì)胞凋亡情況 以每孔5×10個(gè)細(xì)胞接種6 孔板，加完全培養(yǎng)液0.5 ml，洗滌；0.25%胰蛋白酶消化，離心。細(xì)胞調(diào)亡分析：加195 μl Annexin V-FITC 結(jié)合液（購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司）重懸細(xì)胞，加5 μl結(jié)合液，混勻，孵育，加結(jié)合液重懸細(xì)胞。

1.2.6 MTT 檢測(cè) 選擇3 對(duì)Bcl-XL 進(jìn)行后續(xù)研究，HL-60 細(xì)胞以2×10/孔接種96 孔板，將細(xì)胞分成3組，具體步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行，結(jié)果得到OD 值，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率[抑制率（%）=（1-樣品孔OD 值/空白對(duì)照孔OD 值）×100%]，然后再根據(jù)改良寇式法計(jì)算出各組藥物的IC值。

1.2.7 檢測(cè)采用 免疫印跡 P-JNK、AMPK、mTOR、P70S6K 表達(dá)。選取細(xì)胞株，離心得提取液，根據(jù)總蛋白體取試劑盒（上海尚寶生物科技有限公司）提取蛋白質(zhì)濃度。取適量蛋白濃度進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分離。洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的細(xì)胞，孵育，洗膜。結(jié)果用LabWorks3.0 軟件以目的條帶β-actin 的灰度值進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組Bcl-XL 的表達(dá)

Bcl-XL 下調(diào)組Bcl-XL 表達(dá)低于急性髓系白血病組和陰性對(duì)照組，陰性對(duì)照組低于急性髓系白血病組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組Bcl-XL 的表達(dá)（）

2.2 各組細(xì)胞增殖能力比較

在24、48、72 h，下調(diào)Bcl-XL 組細(xì)胞吸光密度值均低于急性髓系白血病組和陰性對(duì)照組，陰性對(duì)照組低于急性髓系白血病組（均P＜0.05），其中在72 h 差異表現(xiàn)最為明顯；陰性對(duì)照組和急性髓系白血病組隨著時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞吸光密度值逐漸升高，下調(diào)Bcl-XL組逐漸降低（均P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞吸光密度值比較（）

2.3 各組細(xì)胞72 h 凋亡情況比較

下調(diào)Bcl-XL 組細(xì)胞胞漿減少、細(xì)胞核染色質(zhì)固縮偏向一邊、細(xì)胞體積明顯變小，表面有凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，并可見(jiàn)細(xì)胞碎片；陰性對(duì)照組數(shù)量與急性髓系白血病組相比較少。見(jiàn)封三圖2。

2.4 各組間急性髓系白血病細(xì)胞對(duì)Bcl-XL 的IC50值

急性髓系白血病組IC值高于陰性對(duì)照組、下調(diào)Bcl-XL 組；下調(diào)Bcl-XL 組IC值低于陰性對(duì)照組（均P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組間急性髓系白血病細(xì)胞對(duì)Bcl-XL 的IC50 值（）

2.5 各組P-JNK、AMPK、mTOR、P70S6K 蛋白相對(duì)表達(dá)量

下調(diào)Bcl-XL 組P-JNK、AMPK、mTOR、P70S6K表達(dá)分別低于其他兩組；陰性對(duì)照組低于急性髓系白血病組（均P＜0.05）。見(jiàn)表4、圖1。

圖1 各組細(xì)胞P-JNK、AMPK、mTOR、P70S6K 蛋白表達(dá)比較（W B圖）

表4 各組P-JNK、AMPK、mTOR、P70S6K 蛋白相對(duì)表達(dá)量（）

3 討論

急性髓系白血病是臨床一種嚴(yán)重的致死性疾病，白血病是造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，是常見(jiàn)的惡性血液系統(tǒng)疾病，主要是因細(xì)胞凋亡受抑制、分化受阻、增殖不受控制，致造血細(xì)胞停留在造血的不同階段。化療是目前的主要治療方法，但不能有效延長(zhǎng)生存期，因此誘導(dǎo)凋亡為白血病治療帶來(lái)新的希望。抑制正常的造血功能是因?yàn)榘籽〖?xì)胞在骨髓和其他造血組織的大量增殖、浸潤(rùn)。因此，本文旨在研究基于JNK/AMPK-mTOR 調(diào)控Bcl-XL 對(duì)急性髓系白血病細(xì)胞化療敏感度的干預(yù)作用。

有資料顯示JNK 有雙向作用，既可抑制細(xì)胞凋亡，也可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這取決于不同的細(xì)胞類型。AMPK 通過(guò)抑制mTOR 信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制增殖，抑制多種惡性腫瘤的發(fā)生。Pei等研究表明AMPK 調(diào)節(jié)炎癥可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期停滯、代謝變化，從而抑制癌癥。mTOR 在細(xì)胞分化、生長(zhǎng)及增殖中具有重要的調(diào)節(jié)作用。

董紅娟等報(bào)道Bcl-XL 基因介導(dǎo)白血病細(xì)胞耐藥的形成。抑制細(xì)胞凋亡的能力，降低細(xì)胞凋亡的閾值通過(guò)阻止Bcl-XL 表達(dá)，恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物治療的敏感度。調(diào)節(jié)凋亡蛋白的表達(dá)與急性白血病化療效果關(guān)系通過(guò)研究Bcl-XL 的表達(dá)，急性白血病化療效果與Bcl-XL 關(guān)系的研究也有報(bào)道，特別是對(duì)抗凋亡蛋白Bcl-2 在不同預(yù)后的急性白血病患者細(xì)胞中的表達(dá)研究較多。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)Bcl-XL后急性髓系白血病細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加。細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)是凋亡調(diào)節(jié)因子組成和完成的，對(duì)個(gè)別凋亡調(diào)節(jié)蛋白與急性白血病化療效果的研究不夠全面。

本研究結(jié)果顯示下調(diào)Bcl-XL 組IC值降低，說(shuō)明下調(diào)bcl-XL 組增強(qiáng)急性髓系白血病細(xì)胞化療敏感度。Bcl-XL 的低表達(dá)使多種細(xì)胞毒化療藥物耐受性對(duì)腫瘤細(xì)胞增加，促進(jìn)凋亡。最近有文獻(xiàn)報(bào)道，Bcl-XL的高低與肝癌、卵巢癌細(xì)胞、急性髓系白血病中對(duì)化療藥物的敏感度密切相關(guān)，可降低急性髓系白血病細(xì)胞化療敏感度。

P-JNK 通過(guò)使c-jun 等63、73 位絲氨酸雙磷酸化，調(diào)節(jié)AP-1 家族成員的轉(zhuǎn)錄活性，將信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞內(nèi)部。AMPK 一方面通過(guò)調(diào)節(jié)代謝恢復(fù)細(xì)胞能量，另一方面可通過(guò)抑制下游信號(hào)分子mTOR 活性抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及增加細(xì)胞自噬水平。雌激素受體過(guò)表達(dá)可激活A(yù)MPK，抑制mTOR，進(jìn)而誘導(dǎo)人急性髓系白血病細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞增殖。P70S6K 在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖中起著明顯的重要作用。本文研究結(jié)果顯示，下 調(diào)Bcl-XL 組增殖蛋白mTOR、P70S6K、P-JNK、AMPK 表達(dá)抑制急性髓系白血病細(xì)胞增殖。

綜上所述，通過(guò)JNK/AMPK-mTOR 信號(hào)通路下調(diào)Bcl-XL，能改善急性髓系白血病細(xì)胞化療敏感度，抑制急性髓系白血病細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，為臨床急性髓系白血病細(xì)胞化療敏感度治療提供理論依據(jù)。