CircRNA_000809通過miR-200c-3p對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥間質(zhì)細(xì)胞的增殖、遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

徐超逸，陳海燕，陳賽玲，張銘瑤，梁宗文，段萍

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325027；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，黑龍江 哈爾濱 150086

子宮內(nèi)膜異位癥的特征是有活性的子宮內(nèi)膜樣組織種植在子宮體以外的部位[1]，引起盆腔包塊、進(jìn)行性加重的痛經(jīng)、性交痛以及不孕等[2]。有10%～15%的育齡期女性受其困擾[3]，但目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確[4]。環(huán)狀RNA（circularRNAs,circRNA）是一類廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，且具有調(diào)控基因表達(dá)作用的內(nèi)源性非編碼RNA[5-6]。根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA理論，circRNAs可以作為內(nèi)源性分子海綿與微小RNAs（miRNAs）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，調(diào)控靶mRNA表達(dá)[7]。本課題組前期研究結(jié)果表明miR-200c-3p可以抑制異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞（ectopic endometrial stromal cells,EESCs）增殖及遷移能力[8]。本研究進(jìn)一步利用基因芯片篩選出與miR-200c-3p相互作用的circRNAs。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）結(jié)果顯示circRNA_000809在子宮內(nèi)膜異位癥組織中表達(dá)上調(diào)，miR-200c-3p表達(dá)下調(diào)；同時(shí)靶基因預(yù)測(cè)顯示miR-200c-3p與circRNA_000809存在結(jié)合位點(diǎn)，且在子宮內(nèi)膜異位癥組織中miR-200c-3p與circRNA_000809的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。敲低circRNA_000809引起的EESCs增殖、遷移能力及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）相關(guān)蛋白ZEB1/ZEB2的表達(dá)下降，可以一定程度被miR-200c-3pinhibitor逆轉(zhuǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標(biāo)本：收集2020年1月至2022年1月于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院行卵巢囊腫剝除術(shù)患者的卵巢巧克力囊腫組織25例，設(shè)為子宮內(nèi)膜異位癥組；收集25例因早期宮頸癌行子宮切除術(shù)或者行宮腔鏡檢查的育齡期非子宮內(nèi)膜異位癥患者的子宮內(nèi)膜組織，設(shè)為正常子宮內(nèi)膜組。納入研究的25例子宮內(nèi)膜異位癥組年齡為25～39（32.0±3.1）歲，25例正常內(nèi)膜組年齡為26～41（32.5±3.1）歲，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。所有患者的月經(jīng)周期正常，并且至少在6個(gè)月內(nèi)沒有性激素藥物治療。所有的組織樣品均在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院手術(shù)時(shí)收集，將標(biāo)本快速儲(chǔ)存到液氮中以備后用。本研究已獲得溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（編號(hào)：LCKY2020-88），患者均簽署知情同意書。

1.1.2 試劑：Lipofectamine3000購(gòu)自杭州禹?yè)P(yáng)科技有限公司；si-NC、si-circRNA_000809、inhibitor NC與miR-200c-3p inhibitor購(gòu)自廣州銳博生物公司；TRIzol試劑購(gòu)自杭州禹?yè)P(yáng)科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自日本東洋紡公司；qRT-PCR試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；EdU試劑盒購(gòu)自上海碧云天科技有限公司；兔抗人ZEB1、ZEB2和Vimentin抗體購(gòu)自武漢三鷹科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和qRT-PCR：使用TRIzol試劑從冷凍組織的異位子宮內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜中提取總RNA，并用200 mL無(wú)核酸酶的水洗脫，NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，樣品在260 nm/280 nm的吸光度比要求在1.8～2.0間。取1.0 μg總RNA于反轉(zhuǎn)錄試劑盒中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94 ℃、10 min預(yù)變性；95 ℃、30 s，60 ℃、20 s，72 ℃、20 s，循環(huán)40次。以小核RNA（snRNA）U6作為內(nèi)參，使用2-△△Ct方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.2 人EESCs的原代培養(yǎng)：人EESCs的提取參照文獻(xiàn)[9-10]。用含2%青霉素-鏈霉素的枸櫞酸鹽緩沖液（PBS）沖洗異位子宮內(nèi)膜組織，然后將其切成約1 mm3的碎片，并在膠原酶IV（5 mg/mL，15 U/mg）溶液中水浴消化1 h。通過400目的過濾器（美國(guó)紐約Falcon公司）分離EESCs，并用含10%胎牛血清（FBS）和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基懸浮EESCs。將細(xì)胞置入75 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在含5% CO2的37 ℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。利用波形蛋白（vimentin）的免疫熒光化學(xué)染色進(jìn)行細(xì)胞純度鑒定。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：si-NC、si-circRNA_000809、inhibitor NC與miR-200c-3pinhibitor均使用Lipofectamine 3000作為脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。inhibitor NC與miR-200c-3pinhibitor的濃度為100 nmoL/L，si-NC與si-circRNA_000809的濃度為50 nmoL/L。siNC（小干擾RNA陰性對(duì)照）+inhibitor NC（核酸抑制劑陰性對(duì)照），si-circRNA_000809（circRNA_000809小干擾RNA）+inhibitor NC和si-circRNA_000809+miR-200c-3pinhibitor（miR-200c-3p核酸抑制劑）。

1.2.4 細(xì)胞增殖能力測(cè)定：先將EESCs在無(wú)血清培養(yǎng)基中饑餓24 h。轉(zhuǎn)染24 h后使用5-乙炔基-2’-脫氧尿苷（EdU）分析試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。通過將EdU陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量除以DAPI染色的細(xì)胞總數(shù)，可以計(jì)算出EdU陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。所有實(shí)驗(yàn)需進(jìn)行至少3次。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力：取各組轉(zhuǎn)染24 h的EESCs，懸浮在200 μL DMEM中加至上層小室，將含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液加700 μL至下層小室，繼續(xù)培養(yǎng)36 h，多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，應(yīng)用顯微鏡測(cè)量遷移細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法：以含有1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液100 μL提取轉(zhuǎn)染48 h的EESCs總蛋白，吸取蛋白樣品20 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并用300 mA的電流將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，快速封閉液封閉15 min后，分別于4 ℃孵育一抗稀釋液（兔抗人ZEB1、ZEB2及ACTB抗體，均為1:500）18 h，于室溫孵育二抗稀釋液（HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗，1:3 000）1 h，在ECL中顯影，采用ImageJ軟件分析各條帶相對(duì)于內(nèi)參ACTB的灰度值之比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用Graphpad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用表示。2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組子宮內(nèi)膜組織中circRNA_000809表達(dá)比較circRNA_000809在異位子宮內(nèi)膜組的表達(dá)水平較正常子宮內(nèi)膜組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見圖1。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)circRNA_000809在正常子宮內(nèi)膜組織和異位子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平

2.2 EESCs中circRNA_000809與miR-200c-3p相關(guān)性分析 qRT-PCR結(jié)果顯示，與正常內(nèi)膜組織比，miR-200c-3p在異位內(nèi)膜組織中表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2A。StarBase軟件預(yù)測(cè)，circRNA_000809與miR-200c-3p間存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖2B。circRNA_000809和miR-200c-3p相關(guān)性分析顯示，EESCs中兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.56，P=0.03），見圖2C。為證實(shí)circRNA_000809與miR-200c-3p間調(diào)控關(guān)系，用si-circRNA_000809（circRNA_000809小干擾RNA）轉(zhuǎn)染EESCs，結(jié)果顯示敲低circRNA_000809可以上調(diào)miR-200c-3p的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=19.32，P＜0.05），見圖2D。

圖2 EESCs中circRNA_000809與miR-200c-3p相關(guān)性分析

2.3 敲低circRNA_000809對(duì)EESCs增殖能力的影響 分別用siNC+inhibitor NC、si-circRNA_000809+inhibitor NC和si-circRNA_000809+miR-200c-3pinhibitor共轉(zhuǎn)染EESCs。與siNC+inhibitor NC組比，si-circRNA_000809+inhibitor NC組EESCs增殖能力減弱，而si-circRNA_000809+miR-200c-3pinhibitor組EESCs增殖能力較si-circRNA_000809+inhibitor NC組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3A和圖3B。這表明miR-200c-3pinhibitor使EESCs增殖能力一定程度回升，敲低circRNA_000809通過下調(diào)miR-200c-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)EESCs增殖能力。

圖3 敲低circRNA_000809對(duì)EESCs增殖能力的影響

2.4 敲低circRNA_000809對(duì)EESCs遷移能力的影響 與siNC+inhibitor NC組比，si-circRNA_000809+inhibitor NC組EESCs遷移能力減弱，而si-circRNA_000809+miR-200c-3pinhibitor組與si-circRNA_000809+inhibitor NC組比EESCs遷移能力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4A和圖4B。敲低circRNA_000809通過下調(diào)miR-200c-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)EESCs遷移能力。

圖4 敲低circRNA_000809對(duì)EESCs遷移能力的影響

2.5 敲低circRNA_000809對(duì)ZEB1/ZEB2蛋白表達(dá)的影響 與siNC+inhibitor NC組比，si-circRNA_000809+inhibitor NC組ZEB1/ZEB2蛋白水平顯著下調(diào)，而si-circRNA_000809+miR-200c-3pinhibitor組ZEB1/ZEB2蛋白水平較si-circRNA_000809+inhibitor NC組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）見圖5A-C。敲低circRNA_000809通過下調(diào)miR-200c-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)EESCs ZEB1/2蛋白表達(dá)水平。

圖5 敲低circRNA_000809對(duì)ZEB1/2蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥指有活性的子宮內(nèi)膜組織生長(zhǎng)在子宮體以外的部位，常見于卵巢、子宮骶韌帶以及子宮直腸陷凹，引起盆腔包塊、進(jìn)行性加重的痛經(jīng)、性交痛以及不孕等，嚴(yán)重影響患者身心健康及生活質(zhì)量[11-12]。子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)，在育齡期女性中發(fā)病率為10%～15%，在不孕患者中發(fā)病率高達(dá)30%～50%，給患者帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[13-14]。但其發(fā)病機(jī)制仍不清楚，目前主要包括一些理論學(xué)說(shuō)，經(jīng)血逆流學(xué)說(shuō)，體腔上皮化生學(xué)說(shuō)，淋巴、血行轉(zhuǎn)移及炎癥免疫學(xué)說(shuō)等[15]，但這些學(xué)說(shuō)均不能完全解釋子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制，因此探討其發(fā)病機(jī)制是當(dāng)前子宮內(nèi)膜異位癥的研究熱點(diǎn)。

非編碼RNA，如circRNA和miRNA是無(wú)蛋白編碼能力的功能性RNA分子。circRNAs結(jié)構(gòu)上以共價(jià)閉合環(huán)的形式替代了5’末端帽子和3’末端的多聚腺苷酸尾結(jié)構(gòu)[6]。隨著相關(guān)研究的深入，越來(lái)越多的證據(jù)表明circRNAs參與了多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，而且circRNAs可作為miRNAs的內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)性RNA（competing endogenouse,ceRNA）參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生及發(fā)展過程[16]。下調(diào)circ_0000673通過miR-616-3p/PTEN軸促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞增殖和遷移[17]。circZFPM2通過調(diào)控miR-205-5p/ZEB1信號(hào)通路促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥EMT[18]。miR-200c-3p是一個(gè)良好的抑癌基因[19]，且前期研究結(jié)果表明miR-200c-3p可以抑制EESCs的眾多表型，但是在子宮內(nèi)膜異位癥中尚未見報(bào)道內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)miR-200c-3p從而共同調(diào)控子宮內(nèi)膜異位癥進(jìn)程的circRNAs。

本研究利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)circRNA_000809與miR-200c存在結(jié)合位點(diǎn)，且用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到，與正常內(nèi)膜組織相比，circRNA_000809在異位內(nèi)膜組織中呈高表達(dá)，提示circRNA_000809可能在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)敲低circRNA_000809后miR-200c-3p的表達(dá)量上調(diào)。miR-200c-3p在子宮內(nèi)膜異位癥中呈低表達(dá)，相關(guān)性分析表明circRNA_000809與miR-200c-3p在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果說(shuō)明，circRNA_000809可作為miR-200c-3p的ceRNA參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展。利用回復(fù)實(shí)驗(yàn)對(duì)該結(jié)論進(jìn)行了驗(yàn)證，其結(jié)果也表明敲低circRNA_000809對(duì)EESCs增殖能力及遷移能力的抑制，可以通過共轉(zhuǎn)染miR-200c-3pinhibitor得到逆轉(zhuǎn)，進(jìn)一步說(shuō)明circRNA_000809與miR-200c-3p的相互作用可以調(diào)控子宮內(nèi)膜異位癥進(jìn)程。

研究表明，EMT在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。EMT參與了子宮內(nèi)膜異位癥局部病灶的形成，局部炎癥的損傷、修復(fù)和纖維化過程[20]。EMT相關(guān)蛋白ZEB1和ZEB2是miR-200c-3p已知的靶基因[19]。本研究發(fā)現(xiàn)敲低circRNA_000809可以抑制EMT相關(guān)蛋白ZEB1/ZEB2的表達(dá)，并可以被miR-200c-3p在一定程度上逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果表明circRNA_000809通過作用于miR-200c-3p調(diào)控ZEB1/ZEB2的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控EMT的進(jìn)展，從而影響子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，circRNA_000809在子宮內(nèi)膜異位癥中表達(dá)水平升高，而miR-200c-3p的表達(dá)水平降低。circRNA_000809通過ceRNA機(jī)制調(diào)控miR-200c-3p，進(jìn)而調(diào)控EESCs的增殖、遷移及EMT相關(guān)蛋白ZEB1/ZEB2的表達(dá)。circRNA_000809/miR-200c-3p/EMT軸可能成為子宮內(nèi)膜異位癥分子治療的潛在靶點(diǎn)。