溫陽消癥方對5/6腎切除小鼠腎纖維化的作用及其機制

余柯娜，何立群，林曉蒙，蔡旭東

1.寧波市中醫(yī)院 腎病科，浙江 寧波 315000；2.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院 腎病科，上海 200021

各類慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）終末期不良結局的病理特征是腎纖維化，包括腎小球硬化和腎間質纖維化，其疾病階段和病變程度與CKD進展至終末期腎臟病（end stage renal disease,ESRD）的程度息息相關。腎纖維化過程涉及生長因子眾多，信號通路錯綜復雜，除經典TGF-β/Smad通路外，Janus激酶2/信號轉導子與轉錄激活子3（Janus kinase 2/signal transducers and activators of transcription 3,JAK2/STAT3）信號旁路也可參與腎纖維化。抗腎纖維化藥物研發(fā)往往只能從單一途徑入手，臨床收效甚微。

溫陽消癥方是于補虛消癥方[1]之上巧辨陰陽而衍化應用于臨床的，動物實驗證明其可保護5/6腎切除小鼠腎功能，減輕腎纖維化病理表現(xiàn)，改善單側輸尿管結扎（unilateral ureteral obstruction,UUO）小鼠腎纖維化程度[2-3]。本研究通過建立小鼠5/6腎切除腎纖維化模型，圍繞TGF-β1/Smad3、JAK2/STAT3信號通路展開討論，比較各組小鼠腎組織JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3、轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）、Smad3、I型膠原蛋白（Collagen-I,Col-I）、III型膠原蛋白（Collagen-III,Col-III）和α-平滑肌肌動蛋白（alpha smooth muscle actin,α-SMA）的表達差異，探究溫陽消癥方在抗腎纖維化方面的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級雄性C57小鼠32只（8周齡），體質量（20.0±1.5）g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供[許可證號：SCXK（滬）2017-0005]，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心[許可證號：SYXK（滬）2020-0009]。實驗期間自由飲食飲水，飼料由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，適應性喂養(yǎng)1周后進行動物模型制作。

1.1.2 藥物：溫陽消癥方（組成：黃芪30 g，黨參30 g，淫羊藿15 g，肉蓯蓉15 g，桃仁12 g，川芎15 g，莪術30 g），由寧波明貝中藥業(yè)有限公司提供中藥，煎煮成湯劑。代文由北京諾華制藥有限公司生產，批號：H20040216。

1.1.3 試劑：RIPA裂解液（LP002）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（×2）（PWE-003A）、Super-GL ECL超敏發(fā)光液（PWB-001S）均由上海諾倫生物科技有限公司提供，JAK2一抗（ab108596，1:100稀釋）、STAT3一抗（ab68153，1:100稀釋）、TGF-β1一抗（ab92486，使用濃度1:500）、Smad3一抗（ab40854，1:500稀釋）、α-SMA一抗（ab32575，1:1 000稀釋）、Col-I一抗（ab138492，1:200稀釋）、Col-III一抗（ab6310，1:200稀釋）由美國Abcam公司提供；p-JAK2一抗（cst8082s，1:100稀釋）、p-STAT3一抗（cst9145p，1:100稀釋）由美國CST公司提供；抗GAPDH小鼠單克隆抗體（G8795，1:10 000稀釋）由美國Sigma公司提供；GAPDH二抗（115035003，1:2 000稀釋，山羊抗鼠）由美國Jakson公司提供，其余指標二抗為山羊抗兔（111035003，1:2 000稀釋），由美國Jakson公司提供。

1.2 方法

1.2.1 模型建立：從32只C57小鼠中隨機選取24只小鼠，用PLATT法[4]制作5/6腎切除慢性腎功能衰竭腎纖維化模型。于手術臺上放置成人尿墊，模型組小鼠于異氟烷吸入麻醉后手術，于左肋下1 cm處行一斜向外下方切口（小鼠：0.8～1 cm），切口約與鼠體長縱軸向內成45°，暴露左側腎臟，分離腎周圍脂肪并剝離腎外包膜后切除腎上下極組織各1/3，用明膠海綿壓迫止血10 min后復位腎臟并縫合。一周后行2期手術，同樣手法麻醉，切開右背暴露右腎，結扎腎蒂后切除整個右腎。故兩次手術共切除約70%腎臟。另8只C57小鼠作為假手術組，兩次手術中，僅僅暴露雙側腎臟并分離腎周脂肪、包膜后縫合。

1.2.2 分組：小鼠進入實驗室適應性喂養(yǎng)1周后，隨機取8只為假手術組，其余24只為造模組，將造模組小鼠按上述方法制作慢性腎功能衰竭動物模型，術后2周行小鼠目內眥采血，測定腎功能，按血清肌酐值將小鼠分為模型組、溫陽消癥方組和代文組，使三組間血清肌酐值差異無統(tǒng)計學意義。

1.2.3 給藥方法與療程：溫陽消癥方：中藥相當于成人等效劑量，人鼠劑量20倍換算，煎煮成湯劑，0.98 g（0.2 mL）/20 g小鼠，連續(xù)灌胃8周。代文：人鼠劑量12.33倍換算，0.33 m（g0.2 mL）/20 g小鼠，連續(xù)灌胃8周。

1.2.4 取材：治療8周后，用10%水合氯醛0.15 mL/25 g對所有小鼠麻醉后取血，將血液離心后收集血清，留取腎組織。腎組織：留取假手術組小鼠腎組織和其余小鼠殘腎，沿腎組織冠狀面縱軸分離等大后一半置于-80 ℃冰箱中保存，另一半置于4%多聚甲醛中用于HE、Masson染色和免疫組織化學的檢測。另于低溫（4 ℃）、活體、快速用雙面刀片取1 mm3的腎臟組織置于戊二醛中，避免組織擠壓損傷，后迅速送往上海中醫(yī)藥大學電鏡室。

1.2.5 蛋白質印跡（Western blot）法：用Western blot法測定腎臟組織的JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3、TGF-β1、Smad3、α-SMA、Col-I、Col-III。將樣本12 000×g離心5 min后除去沉淀，加入300 μL裂解液中，混勻使其完全裂解后移至離心管。從離心管中取10 μL樣本加入10 μL SDS-PAGE（×2）混勻，100 ℃加熱處理5 min，冰上冷卻。使用10%SDS-PAGE分離，每孔上樣量為20 μL。電泳結束后，將在轉換液浸泡過的凝膠、濾紙和在甲醇中浸泡過的PVDF膜一起4 ℃放置10 min，然后制備轉移三明治。使用Semi-Dry Cell進行半干電泳轉移，轉移條件為30 mA，90 min。將轉印膜4 ℃封閉過夜，第2天用TBST洗滌3次，每次15 min。加入稀釋好的一抗，37 ℃溫育2 h。用TBST洗滌4次，每次10 min。加入稀釋好的二抗，37 ℃溫育2 h。用TBST洗滌4次，每次10 min。用超敏發(fā)光液檢測，并對X光片曝光、顯影、定影，用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，采用Gel-Pro Analyzer軟件來分析處理。

1.2.6 實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction,RTqPCR）法：RT-qPCR法測定腎組織TGF-β1 mRNA表達，按照Genbank數(shù)據(jù)庫中公開發(fā)表的基因序列，采用primer express引物設計軟件，設計TGF-β1引物。采用TRIzol法提取細胞總RNA，將mRNA反轉錄為cDNA模板，進行RT-qPCR實驗。TGF-β1引物序列：上游引物5’-GCTGCGCTTGCAGAGATTAAAATC-3’，下游引物5’-AGGTAACGCCAGGAATTGTTGCTA-3’；Smad3引物序列：上游引物5’-CACGCAGAACGTGAACACC-3’，下游引物5’-GGCAGTAGATAACGTGAGGGA-3’；以β-actin為內參，引物序列：上游引物5’-AAGATCAAGATCATTGCTCCTCC-3’，下游引物5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGC-3’。擴增條件：95 ℃，變性3 min；然后按下述條件循環(huán)40次；95 ℃變性12 s，62 ℃退火40 s。程序運行結束后，分析各基因的實時擴增曲線和熔解曲線。取Ct值，按2-ΔΔCt法計算待測目的基因相對表達量。

1.2.7 免疫組織化學染色：采用3 μm石蠟包埋腎臟組織切片進行免疫組織化學染色分析。用3% H2O2封閉，用0.01 mol/L PBS洗滌2次，每次5 min。然后加入100 μL血清，37 ℃孵育30 min，與α-SMA抗體（1:200）、Col-I（1:200）抗體、Col-III（1:200）抗體4 ℃孵育過夜。第2天，用PBS洗滌染色切片3次，并在37 ℃下與HRP標記的二級抗體孵育30 min，然后再次用PBS洗滌3次。通過DBA染色觀察組織切片，用自來水沖洗10 min，用蘇木素反向染色45 s，沖洗10 min，脫水，封片。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用表示，2組比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠腎功能比較 5/6腎切除手術過程中，有3只小鼠死亡，術后2周內再次出現(xiàn)3只小鼠死亡。故術后2周將剩余18只小鼠分為5/6腎切除組、代文組和溫陽消癥方組，使3組肌酐值差異無統(tǒng)計學意義。為使各組小鼠數(shù)量均衡，假手術組小鼠僅取6只進行后續(xù)研究。與假手術組比較，5/6腎切除組血肌酐和血尿素氮含量升高（P＜0.01）；與5/6腎切除組比較，溫陽消癥方組、代文組血肌酐和血尿素氮含量減低（P＜0.01）。見表1。

表1 各組小鼠血清肌酐及尿素氮檢測結果（每組n=6，）

表1 各組小鼠血清肌酐及尿素氮檢測結果（每組n=6，）

與假手術組比：aP＜0.01；與5/6腎切除組比：bP＜0.01

2.2 小鼠腎組織病理改變

2.2.1 小鼠腎組織HE染色：5/6腎切除組小鼠病理形態(tài)表現(xiàn)為腎小管擴張，腎小管蛋白管型形成及部分腎小管壞死，腎間質表現(xiàn)為炎癥細胞增多和纖維化形成；代文組、溫陽消癥方組均可見腎小管壞死，腎間質炎性細胞浸潤，蛋白管型較5/6腎切除組少，腎間質纖維化范圍較模型組小，總體病變程度較模型組輕。見圖1。

圖1 各組小鼠腎臟HE染色結果

2.2.2 小鼠腎組織Masson染色：5/6腎切除組小鼠腎組織藍染的膠原面積較大，主要分布在腎小管、腎間質以及部分硬化的腎小球內部，代文組、溫陽消癥方組腎組織藍染的膠原面積較小，主要分布在腎小管及腎間質。見圖2。與假手術組比較，5/6腎切除組膠原陽性率升高（P＜0.01）；與5/6腎切除組比較，溫陽消癥方組、代文組膠原陽性率減低（P＜0.01）。見圖3。

圖2 各組小鼠腎臟Masson染色結果

圖3 各組小鼠腎臟Masson染色膠原陽性率比較

2.2.3 腎組織電鏡表現(xiàn)：5/6腎切除組成纖維細胞增多，基質增寬，線粒體嵴斷裂，線粒體腫脹，間質膠原增多；代文組、溫陽消癥方組成纖維細胞數(shù)量及間質膠原范圍均較5/6腎切除組減少。見圖4。

圖4 各組小鼠腎組織透射電鏡結果（×4 200）

2.3 免疫組織化學結果 5/6腎切除組小鼠腎組織中α-SMA、Col-I、Col-III蛋白陽性黃染面積較其他組更大，顏色更深，陽性黃染部位主要分布在腎小管、腎間質。代文組、溫陽消癥方組的陽性黃染主要分布在腎小管、腎間質，其面積較5/6腎切除組小，顏色較5/6腎切除組淺。見圖5。5/6腎切除組小鼠腎組織Col-I、Col-III、α-SMA蛋白含量均高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與5/6腎切除組比，溫陽消癥方組、代文組小鼠腎組織α-SMA、Col-I、Col-III蛋白含量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與代文組比較，溫陽消癥方組Col-I、Col-III蛋白含量較低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而α-SMA蛋白含量在兩治療組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖6。

圖5 各組小鼠腎組織α-SMA（A）、Col-I（B）、Col-III（C）免疫組織化學結果

圖6 各組小鼠腎組織α-SMA、Col-I、Col-III免疫組織化學半定量表達結果

2.4 Western blot檢測結果 5/6腎切除組小鼠腎組織JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3、TGF-β1、Smad3、Col-I、Col-III、α-SMA蛋白含量均高于假手術組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與5/6腎切除組比較，溫陽消癥方組、代文組小鼠腎組織JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3、TGF-β1、Smad3、α-SMA、Col-I、Col-III蛋白含量均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與代文組比較，溫陽消癥方組JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3、Smad3、Col-I、Col-III、α-SMA蛋白含量較低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而TGF-β1蛋白含量在兩治療組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖7。

圖7 各組小鼠腎組織JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3、Col-I、Col-III、α-SMA、TGF-β1、Smad3蛋白表達結果

2.5 RT-qPCR結果 5/6腎切除組小鼠腎組織TGF-β1、Smad3 mRNA含量均高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與5/6腎切除組比較，溫陽消癥方組、代文組小鼠腎組織TGF-β1、Smad3 mRNA含量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與代文組比較，溫陽消癥方組TGF-β1、Smad3 mRNA含量較低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖8。

圖8 各組小鼠腎組織TGF-β1、Smad3 mRNA表達結果

3 討論

作為各類CKD通往ESRD的共同病理路徑，腎臟纖維化是一系列疾病因子縱橫交錯所致的瀑鏈式反應，其病理發(fā)生過程，涉及生長因子、炎癥反應、腎小管上皮細胞-肌成纖維細胞轉分化（tubular epithelial myofibroblast trans-differentiation,EMT）、信號通路、細胞凋亡等。雖然ECM降解劑/抑制劑、TGF-β1單克隆抗體、內皮素受體拮抗劑、炎癥因子抑制劑、HIF-1α抑制劑、基因靶向治療、干細胞移植治療等[5-6]均能圍繞腎纖維化單一病理途徑開展治療，然而腎纖維化涉及作用靶點之多可能使得各通路間相互干擾，并且其治療效果也視所處病理階段而定，因此延緩甚或逆轉腎纖維化藥物的開發(fā)仍難有重大突破，尋找多靶點的抗腎纖維化藥物也成了臨床和實驗室研究亟待解決的難題之一。

近年來，中醫(yī)藥多靶點干預治療在多領域凸顯鋒芒，研究者也開始充分挖掘其在腎纖維化治療中的巨大優(yōu)勢[7-9]，以期指導臨床。之于慢性腎功能衰竭，中醫(yī)只有“虛勞”“腰痛”“水腫”等病名。究其病因，大多涉及脾腎兩虛、濕熱毒邪和瘀血內阻。溫陽消癥方以“腎虛血瘀”為病因立論，聚焦以溫陽活血之法消腎內微型癥積。淫羊藿、肉蓯蓉補腎溫陽，補助腎衰之根本，桃仁、川芎、莪術三者聯(lián)用行氣活血而使化瘀之力恢宏，黨參、黃芪二者益氣升陽，既助扶陽又益行瘀，此一舉三得。而另有肉蓯蓉填精潤燥、黨參和胃生津之就，使得全方溫而不燥，豐育腎陰。

從中醫(yī)治法宏觀而論，溫陽消癥方可溫陽補腎、活血化瘀。本研究采用5/6腎切除為腎纖維化動物模型，術后小鼠殘腎將逐漸代償增大。我們猜想，溫陽消癥方的干預會否有益于殘腎代償生長中的結構重塑？其是否可以通過補腎填精之力使得殘腎代償產生更多的腎單位，此外其活血化瘀之功是否可同時改善殘腎代償時發(fā)生的纖維化？

從方藥成分微觀分解，溫陽消癥方中藥物有效單體已于腎纖維化研究中展開討論：如黃芪甲苷可通過抑制miR-192表達減輕腎纖維化[10-11]；淫羊藿苷于CKD腎纖維化具治療意義[12]，能改善UUO小鼠及糖尿病大鼠腎小管間質纖維化程度[13-14]；苦杏仁苷[15-16]可通過抗氧化應激、抗炎癥和抗纖維化改善慢性腎衰大鼠腎損傷等。由此，我們期待溫陽消癥方的研創(chuàng)能夠在腎纖維化研究領域中發(fā)揮更加長足的優(yōu)勢。

TGF-β1是成纖維細胞激活的核心介質[17-19]，可以通過Smad依賴和非Smad依賴方式作為關鍵細胞因子參與腎纖維化。Smad蛋白家族龐大，其中僅Smad2/3由TGF-β激活，臨床研究和動物實驗均證實通過經典通路TGF-β1/Smad3的激活介導能夠促進腎纖維化[20-21]。

JAK2/STAT3廣泛存在于各類組織和細胞中，可通過作用多種上下游細胞因子和生長因子廣泛參與細胞的增殖、分化、凋亡和免疫應答[22]。上游細胞因子與其受體結合后，先后使得JAK2、STAT3發(fā)生磷酸化，p-STAT3最終以二聚體形式轉錄到細胞核中，誘導或抑制目的基因表達[23]。腎臟病領域研究中，JAK2/STAT3通路的激活除了參與腎小管上皮細胞損傷或凋亡[24-25]、腎小球系膜細胞增生[26]外，也可參與糖尿病腎病腎纖維化[27]。此外，JAK2/STAT3還與EMT相關[28]，并且STAT3或p-STAT3活性的增加可促進腎間質成纖維細胞的增殖和腎纖維化的進展[29]。除自身參與腎纖維化外，JAK2/STAT3也可通過上調其他多通路而致病[30]。

JAK2/STAT3、TGF-β1/Smad3除通路本身能介導纖維化外，兩者還可通過相互作用共同促進纖維化。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1[31-33]可作為JAK2/STAT3通路的上游細胞因子，通過與受體的結合激活通路并參與腎纖維化，反之，對JAK2/STAT3的抑制也可減少TGF-β1的合成[34]。而在TGF-β誘導的EMT中，IL-6激活的STAT3可促進Smad3的核定位[35]。另外，也有研究顯示TGF-β1/Smad3的激活能通過誘導STAT3磷酸化[36]促進肝纖維化。

本研究同時觀察TGF-β1/Smad3與JAK2/STAT3的變化，探究溫陽消癥方對腎纖維化的作用機制。從中我們得知，模型組α-SMA、Col-I、Col-III蛋白含量較假手術組顯著上調，腎組織內α-SMA、Col-I、Col-III的含量、比例對腎纖維化程度的病理診斷意義重大，結合其腎功能改變及腎組織病理特點，結果提示模型組小鼠腎組織顯著纖維化。溫陽消癥方治療8周后，上述纖維化相關指標蛋白含量下調明顯，表明溫陽消癥方有助于改善腎組織內部膠原含量，于腎纖維化治療有益。我們進一步測定TGF-β1/Smad3及JAK2/STAT3通路指標變化以探究其中作用機制，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠腎組織TGF-β1、Smad3的蛋白及mRNA含量大幅上調，此時，伴隨JAK2/STAT3通路同步激活，JAK2、STAT3發(fā)生磷酸化（p-JAK2、p-STAT3），共同促進腎纖維化。治療8周后，溫陽消癥方組、代文組小鼠腎組織TGF-β1、Smad3含量下調，JAK2、STAT3磷酸化程度減弱，TGF-β1/Smad3、JAK2/STAT3通路被抑制，由此拮抗腎纖維化。而與代文相比，溫陽消癥方對JAK2/STAT3通路的抑制作用更顯著。至于本研究中TGF-β1/Smad3與JAK2/STAT3是否通過協(xié)同作用而加速腎纖維化，目前尚未可知。后期研究中或可選擇阻斷其中一條通路來探究二者在5/6腎切除小鼠中是否存在作用關系。

綜上所述，5/6腎切除小鼠在術后10周發(fā)生腎纖維化，TGF-β1/Smad3及JAK2/STAT3通路同步激活共同促進腎纖維化。溫陽消癥方能夠減輕5/6腎切除小鼠腎組織纖維化程度，保護殘腎功能，延緩慢性腎功能衰竭疾病進程，其中機制可能與抑制TGF-β1/Smad3、JAK2/STAT3信號通路相關。