原花青素聯合胡椒堿通過五羥色胺受體途徑改善慢性應激小鼠抑郁焦慮樣行為

李茹，于雯飄，郭衛，樓永良

溫州醫科大學，浙江 溫州 325035，1.實驗動物中心；2.第一臨床醫學院（信息與工程學院）；3.眼視光學和視覺科學國家重點實驗室；4.檢驗醫學院（生命科學學院）

根據世界衛生組織2017年發布的《抑郁癥和其他常見精神障礙》報告，全球范圍內約有3億人罹患抑郁癥；從2015年開始，抑郁癥已成為造成非致命性健康損失的最大單一因素。慢性不可預知應激（chronic unpredictable mild stress,CUMS）是建立抑郁模型的經典方法[1]，其原理是將小鼠飼養在未知的溫和應激環境中，引起其絕望無助、快感消失等抑郁情緒，誘發動物表現出與抑郁伴焦慮癥患者相似的行為，從而研究抑郁伴焦慮發生的相關機制。

原花青素（proanthocyanidins,OPC）廣泛存在于自然界中，是由三種不同的黃烷-3-醇亞基組成，常被人所知的是單體或兒茶素。近幾年科學家發現OPC具有保護人體健康的功效，特別在抗氧化、心臟保護的抗炎以及抗癌能力等方面的作用[2]。另有研究發現，OPC具有抗抑郁作用，然其在中劑量（40 mg/kg）和高劑量（60 mg/kg）之間的治療效果沒有明顯差異。我們加入可以提高多酚類藥物生物利用度的胡椒堿（piperine,PIP）來解決OPC生物利用度低的問題[3]。研究表明PIP能增強多酚類化合物如姜黃素、漆黃素、白藜蘆醇的抗抑郁樣作用[3-4]。胡慧等[5]指出OPC聯合PIP可改善CUMS抑郁樣行為，該作用可能是通過降低腦內單胺氧化酶活性從而增加單胺類神經遞質含量而實現的。5-羥色胺（5-hydroxytryptophan,5-HT）是與心境障礙有關的神經遞質，通過作用于特異的5-HT受體實現多樣的生物學作用。5-HT受體分為7大類（5-HT1-7受體），共有14種亞型[6]，其中5-HT1A受體與抑郁、焦慮密切相關。本研究將進一步從5-HT1A受體來探討OPC聯合PIP的抗抑郁樣作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雄性ICR小鼠，體質量為（20±2）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，飼養于溫州醫科大學實驗動物中心[許可證號為SCXK（滬）2017-0005]。小鼠自由進水、攝食，保持實驗飼養的環境濕度為40%～50%，溫度為（24±1）℃。

1.2 藥品試劑 OPC（批號：ZL2018061503）購自天津尖峰天然產物研究開發有限公司，NAN-190、氟西汀（貨號：78917）、多巴胺（dopamine,DA，批號：BCBV2562）、去甲腎上腺素（norepinephrine,NE，批號：SLBP9361V）、5-HT（批號：091M5163V）均購自美國Sigma公司。OPC和PIP都使用0.5%羧甲基纖維素鈉溶解，溶解后采用小鼠灌胃給藥，氟西汀使用雙蒸水溶解，然后采用小鼠腹腔注射給藥。

1.3 實驗儀器 XW-80A型漩渦混合器（海門其林貝爾儀器制造有限公司），JY92-2D型超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司），Eppendorf 5417R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），ANTEC電化學檢測器（荷蘭安泰克公司），Agilent 1100高效液相儀（美國Agilent公司），色譜柱為Diamonsilim C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.4 動物分組造模及給藥 小鼠按照隨機數字表法分組（每組8只小鼠）：正常組、CUMS組、OPC（12.5、25、50 mg/kg，ig）劑量組聯用PIP（5 mg/kg，ig）、OPC（50 mg/kg，ig）+PIP（5 mg/kg，ig）+NAN-190（0.1 mg/kg，ip）、NAN-190組（0.1 mg/kg，ip）以及氟西汀組（10 mg/kg，ip）。除正常組外，其他各組小鼠均建立慢性不可預知性應激CUMS模型：根據文獻[7]稍作改善，每天隨機給予夾尾1 min、潮濕墊料、傾斜籠子24 h、冷水游泳5 min、禁食24 h、束縛1.5 h、禁水24 h、高速搖晃45 min中的一項，2 d內不能重復并持續21 d。

第21天進行動物行為學實驗，然后快速獲取腦組織，分離小鼠大腦額葉皮層、海馬和下丘腦，放置在超低溫冰箱中保存備用。建模期間根據以上分組給予相應的藥物持續21 d，正常組和CUMS組均給予0.5%羧甲基纖維素鈉。

1.5 新奇食物抑制攝食實驗[8]測試前禁食24 h，開始測試時，將小鼠單獨放在一個測試箱中（長×寬×高=27 cm×16 cm×13 cm）的角落，箱子底部鋪一層1 cm的木屑墊料，中間擺放4顆平時吃的食物。記錄小鼠在5 min內攝食的潛伏期。小鼠在嗅食物或者搬運食物都不計入潛伏期，只有當小鼠開始啃食食物才開始記錄。

1.6 強迫游泳實驗[9]在一個透明的圓柱體（高25 cm，直徑為10 cm）中，注入深度為19 cm的水，將水溫維持在（25±1）℃。每只小鼠單獨放在1個圓柱體內，實驗時間為6 min。在適應期（2 min）后，記錄每只小鼠剩余4 min內在水中保持不動的時間，該時間記為不動時間。

1.7 懸尾實驗[9]在隔音盒（長×寬×高=40 cm×20 cm×60 cm）中進行，用膠帶固定每只老鼠的尾部使其懸空，膠帶距離老鼠尾部尖端1 cm。將小鼠離地20 cm，適應期2 min后進行測試，測試時間為6 min，在6 min內記錄小鼠的不動時間。

1.8 大理石掩埋實驗[10]在盒子（長×寬×高=35 cm×28 cm×16 cm）中鋪上一層5 cm墊料，墊料上放20顆玻璃彈珠（直徑為1.5 cm），記錄被小鼠掩埋的彈珠數量，時間為10 min。被掩埋的玻璃彈珠顆數以玻璃彈珠被掩埋2/3或者珠子全部被掩埋為標準。

1.9 單胺類神經遞質檢測[11]小鼠實驗完畢后斷頭取腦，在準備好的冰板上按照小鼠的腦圖譜快速分離出額葉皮層、海馬和下丘腦的腦區，快速稱重后置于-80 ℃冰箱中保存。取各組小鼠的腦組織，每10 mg的腦組織加入100 μL冰的濃度為0.4 mol/L的高氯酸，超聲勻漿，之后放在冰上繼續裂解90 min。在4 ℃條件下（12 000 r/min）離心20 min，取上清液，加入半量體積的0.2 mol/L枸櫞酸鉀，0.3 mol/L K2HPO4和0.2 mol/LEDTA的混合液。混勻，在4 ℃下避光放置60 min，再次在4 ℃條件下（12 000 r/min）離心20 min，最后取其上清液測定單胺類神經遞質的含量。采用高效液相電化學法測單胺類神經遞質水平。樣品上清液首先使用濾過膜處理（孔徑為0.22 μm），取濾過液20 μL，自動進樣。使用的流動相為0.1 mmol/L EDTA、125 mmol/L枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液（pH=3.05）、1.2 mmol/L辛烷基磺酸鈉和15%甲醇，色譜柱為Diamonsil C18，規格是5 μm，150 mm×4.6 mm，高效液相的流速為0.8 mL/min，腦組織中的單胺及其代謝產物的含量使用ng/g（濕組織）表示。

1.10 統計學處理方法 采用SPSS16.0統計學軟件對數據進行處理，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnettt檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OPC聯用PIP對CUMS小鼠抑郁和焦慮樣行為的影響 相比于正常組，CUMS組小鼠在強迫游泳和懸尾實驗中的不動時間顯著增加（P＜0.01），給予OPC（25和50 mg/kg）聯用PIP（5 mg/kg）可改善由CUMS引發不動時間的增加（P＜0.05，P＜0.01），且其效果與陽性對照藥氟西汀（10 mg/kg）效果一致（P＜0.05）。與CUMS組比，低劑量OPC（12.5 mg/kg）聯用PIP（5 mg/kg）組小鼠的不動時間差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1A、圖1B。

新奇食物抑制攝食實驗結果表明，與正常組相比，CUMS組小鼠的新奇食物抑制攝食潛伏期增加（P＜0.05），給予OPC（25和50 mg/kg）聯用PIP（5 mg/kg）明顯降低CUMS小鼠的攝食潛伏期（P＜0.05，P＜0.01），該效果與陽性對照藥氟西汀（10 mg/kg）的效果一致（P＜0.05）。與CUMS組比，低劑量OPC（12.5 mg/kg）聯用PIP（5 mg/kg）組小鼠新奇食物攝食的潛伏期時間差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1C。

大理石掩埋實驗結果表明，與正常組相比，CUMS小鼠的大理石掩埋顆粒數增加（P＜0.01），口服OPC（25和50 mg/kg）聯用PIP（5 mg/kg）濃度依賴性地降低大理石掩埋的顆粒數（P＜0.05，P＜0.001），該結果與陽性對照藥氟西汀（10 mg/kg）的效果一致（P＜0.05）。與CUMS組比，低劑量OPC（12.5 mg/kg）聯用PIP（5 mg/kg）組大理石掩埋的顆粒數差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1D。

圖1 各組小鼠強迫游泳實驗、懸尾實驗、新奇食物抑制攝食實驗和大理石掩埋實驗結果比較

2.2 OPC與PIP聯用對CUMS小鼠腦內單胺類神經遞質的影響 與正常組相比，CUMS組小鼠在海馬、前額葉皮層和下丘腦中的5-HT含量均減少，差異有統計學意義（P＜0.01）；與正常組相比，CUMS組NE僅在海馬腦區顯著下降（P＜0.05），前額葉皮層和下丘腦NE差異無統計學意義（P＞0.05）；與正常組相比，CUMS組DA在3個腦區中的含量差異無統計學意義（P＞0.05）。OPC（25、50 mg/kg）聯用PIP（5 mg/kg）可以逆轉應激引起的各個腦區5-HT含量降低（P＜0.05），其中OPC（50 mg/kg）聯用PIP（5 mg/kg）減少得最明顯（P＜0.01），但是對NE和DA無影響（P＞0.05），見表1、表2和表3。

表1 各組小鼠海馬腦區中5-HT、NE和DA含量比較（每組n=8，，ng/g）

表1 各組小鼠海馬腦區中5-HT、NE和DA含量比較（每組n=8，，ng/g）

與正常組比：aP＜0.05，bP＜0.01；與CUMS組比：cP＜0.05，dP＜0.01

表2 各組小鼠前額葉皮層腦區中5-HT、NE和DA含量比較（每組n=8，，ng/g）

表2 各組小鼠前額葉皮層腦區中5-HT、NE和DA含量比較（每組n=8，，ng/g）

與正常組比：aP＜0.01；與CUMS組比：bP＜0.05，cP＜0.01

表3 各組小鼠下丘腦區中5-HT、NE和DA含量比較（每組n=8，，ng/g）

表3 各組小鼠下丘腦區中5-HT、NE和DA含量比較（每組n=8，，ng/g）

與正常組比：aP＜0.01；與CUMS組比：bP＜0.05，cP＜0.01

2.3 OPC與PIP聯用通過5-HT1A受體對CUMS小鼠新奇食物抑制攝食及大理石掩埋實驗的影響 如前所述，OPC（25和50 mg/kg）聯用PIP（5 mg/kg）組可改善由CUMS誘發的小鼠抑郁焦慮樣行為，且可逆轉多個腦區內5-HT含量的降低，我們推測這種作用是通過作用于5-HT1A受體而實現的。因此，我們研究5-HT1A受體拮抗劑NAN-190是否可逆轉OPC聯用PIP的效果。結果表明，腹腔注射NAN-190（0.1 mg/kg）可逆轉OPC（50 mg/kg）聯用PIP（5 mg/kg）降低新奇食物抑制攝食的潛伏期及減少大理石掩埋顆粒的效果（P＜0.05），見圖2。

圖2 各組新奇食物抑制攝食潛伏期和大理石掩埋顆粒數

2.4 OPC與PIP聯用通過5-HT1A受體作用對海馬、額葉和下丘腦中5-HT含量的影響 與正常組相比，CUMS組小鼠在海馬、額葉和下丘腦中的5-HT含量均減少，差異有統計學意義（P＜0.01）。OPC（50 mg/kg）聯用PIP（5 mg/kg）可以逆轉應激引起的各個腦區的5-HT含量降低，且差異有統計學意義（P＜0.01），使用NAN-190（0.1 mg/kg）能逆轉OPC（50 mg/kg）聯用PIP（5 mg/kg）腦區中5-HT含量的下降，在海馬和額葉皮層中的影響較顯著（P＜0.01），見表4。

表4 各組小鼠不同部位5-HT含量比較（每組n=8，，ng/g）

表4 各組小鼠不同部位5-HT含量比較（每組n=8，，ng/g）

與正常組比：aP＜0.01；與CUMS組比：bP＜0.01；與OPC（50 mg/kg）+PIP組比：cP＜0.01

3 討論

隨著經濟的高速發展和社會節奏的加快，越來越多的人陷入抑郁和焦慮的泥潭中深受折磨。本研究在傳統的OPC單一治療抑郁焦慮疾病的給藥方式中，提出OPC聯合PIP的給藥方式，在降低藥物治療劑量的基礎上還加強了治療效果。通過實驗結果可知，CUMS小鼠在第21天后出現抑郁和焦慮樣行為，在強迫游泳、懸尾實驗中的不動時間和新奇食物抑制攝食實驗中的攝食潛伏期都顯著提高，由此可知應激后的小鼠求生欲降低、食欲變差、興趣喪失，進入抑郁、恐懼狀態；在大理石掩埋實驗中被掩埋的玻璃彈珠顆粒數增加，說明應激后的小鼠挖掘、挖洞和埋葬行為增加，進入焦慮、強迫和重復狀態。OPC聯合PIP可以逆轉應激引起的行為學改變。在確認造模的穩定性后，后續我們在抑郁癥的3個行為學中選取了一種比較新穎的行為學即新奇食物抑制攝食實驗來驗證拮抗劑對藥物的翻轉作用。進一步研究發現，5-HT1A受體拮抗劑NAN-190能逆轉OPC聯合PIP對行為學的改善作用，表明OPC聯合PIP對CUMS小鼠的改善作用可能是通過5-HT1A受體相關的信號通路而實現的。

抑郁和焦慮障礙已成為嚴重的公共健康問題，但是其發病機制至今不明。目前，多數抗抑郁藥物是通過增加腦內單胺類神經遞質濃度（5-HT、NE和DA）來改善患者的抑郁癥狀。單胺類神經遞質系統調控抑郁涉及多個腦區，其中海馬參與學習和記憶，額葉皮層參與情緒認知、感覺認知和執行功能[12]，下丘腦接受5-HT、NE能和DA能三系統共同的神經支配。這三者的相互作用可共同協調情緒認知和學習記憶等活動，其異常和臨床上抑郁癥或者焦慮癥密切相關[13]。在單胺類神經遞質研究中發現，CUMS小鼠海馬、額葉皮層中的5-HT和NE含量顯著性下降，而DA水平無明顯變化。OPC（25、50 mg/kg）聯合PIP（5 mg/kg）能逆轉各腦區由應激引起的5-HT水平顯著降低的情況，而對海馬腦內NE含量下降的情況無作用。因此可知，OPC聯合PIP的作用是通過增加腦內的5-HT來改善抑郁伴焦慮樣變化，這與胡慧等[5]的研究結果相似。前期研究表明OPC聯合PIP的抗抑郁效果可能是通過抑制MAO-A活性來提高中樞神經系統中的單胺類神經遞質，并且效果優于OPC單獨用藥[5]。由應激引起的抑郁癥與NE相關，且該遞質在HPA軸中扮演著重要的角色[1]，該現象與慢性應激小鼠海馬腦內NE含量顯著下降相一致。然而OPC聯合PIP給藥對該遞質無調節作用，說明OPC聯合PIP沒有通過此機制達到改善抑郁焦慮癥作用。

目前，研究者已經發現腦區中有14種5-HT受體亞型，包括天然受體（5-HT1A、5-HT1B、5-HT1D、5-HT2A、5-HT2B、5-HT2C、5-HT3、5-HT4）和6種重組受體（5-HT1E、5-HT1F、5-HT5A、5-HT5B、5-HT6、5-HT7）[14]。其中5-HT1A受體與調節情緒密切相關，在哺乳動物中，5-HT1A受體分為自身受體和異身受體，其中自身受體位于5-HT神經元中介導負反饋，其主要分布在海馬、額葉皮層、杏仁核、下丘腦等[15-16]。多項研究表明5-HT再攝取抑制劑類藥物的抗抑郁的作用機制是通過海馬齒狀回成熟顆粒細胞中的5-HT1A受體來促進海馬神經元再生，原位雜交研究表明在小鼠齒狀回成熟顆粒細胞中有豐富的5-HT1AmRNA表達[17-18]。研究表明抑郁患者的腦區中5-HT遞質減少，5-HT1A受體含量反而增加，因此使用5-HT重攝抑制劑（氟西汀）等改善抑郁的起效比較慢[19]。YU等[20-21]發現5-HT1A受體拮抗劑NAN-190能逆轉多酚類化合物OPC和反式白藜蘆醇改善慢急性應激引起的行為學變化，如強迫游泳實驗和大理石掩埋實驗。此外，有學者研究發現齊墩果酸具有抗抑郁樣和抗焦慮樣行為的作用，但是其被5-HT1A受體拮抗劑逆轉[22]。本研究為了更進一步驗證OPC聯合PIP的抗抑郁焦慮樣行為學是與5-HT和其受體相關，因此首次采用OPC（50 mg/kg）聯合PIP（5 mg/kg）和5-HT1A受體拮抗劑NAN-190來觀察其對行為學的作用以及5-HT含量的變化，結果表明NAN-190可以逆轉OPC（50 mg/kg）聯合PIP（5 mg/kg）聯用引起的新奇食物抑制攝食時間減少和大理石掩埋顆粒數的減少，其中在新奇食物抑制攝食實驗中改善更明顯。OPC（50 mg/kg）聯合PIP（5 mg/kg）對海馬、額葉皮層和下丘腦中5-HT的改善作用被NAN-190逆轉。

綜上所述，本研究運用CUMS制造抑郁模型，OPC和PIP聯用可以減少CUMS小鼠的新奇食物抑制攝食的潛伏期和大理石掩埋的顆粒數，同時可以導致海馬、額葉皮層和下丘腦單胺類神經遞質含量的變化，其作用機制可能是通過激動中樞神經系統的5-HT1A受體產生抗抑郁效應。