lncRNAH19/Sirt3介導自噬在腦出血后損傷中的作用機制

袁敏 王素潔 李茜 張志月

唐山市工人醫院（河北醫科大學附屬唐山臨床醫學院）（河北唐山063000）

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一種可致命的卒中亞型，由自發性非創傷性出血進入腦實質引起［1］。目前，腦出血尚無有效的治療策略，迫切需要確定針對腦出血的精確機制。自噬被認為是細胞克服外部刺激損傷的自我保護機制，其促進細胞在各種病理過程中的存活［2-4］。全基因組測序技術表明，腦出血影響了各種非編碼RNA（ncRNA）的表達［5］。作為調節性ncRNA，lncRNA（＞200 nt）通過調節發育和疾病相關基因參與某些疾病的發生、發展和病理過程［6-7］。有證據表明，lncRNA H19（以下簡稱H19）是在人腦灰質和白質中表達穩定性最高的10 種lncRNA 之一［8］。H19 在許多中樞神經系統疾病中發揮重要作用，例如H19通過轉錄和轉錄后調控參與顱內動脈瘤的病理生理過程［9］。最近，KIM 等［10］揭示H19 在腦出血后高表達，表明H19 可能作為腦出血的生物標志物。還有文獻表明，H19 與自噬相關的miRNA 或蛋白質相互作用［11-12］。然而，H19 是否參與腦出血損傷病理過程中自噬調節的機制需要進一步探索。因此，本研究通過體內建立腦出血小鼠模型和體外將SH-SY5Y 細胞暴露于氧血紅蛋白（OxyHb）模擬腦出血，共同探討H19 在腦出血損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 84 只成年C57BL/6J（B6）小鼠（8 ～10 周，25 ～30 g，雌性各半）購自北京華阜康生物科技股份有限公司（許可證號SCXK（京）2019-0008）。小鼠在特定的無病原體條件下，允許隨意獲取食物和水。

1.1.2 試劑 膠原酶Ⅳ、MTT 溶液購自美國Sigma-Aldrich 公司；抗LC3、Beclin、p62、Sirt3、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTORβ-actin 和HRP 偶聯的二抗購自英國Abcam 公司；Cy3 標記的山羊抗兔Ig G 購自 上 海Beyotime 公司；OxyHb 購自德國Ruibio 公司；Lipo2000 購自美國Invitrogen 公司；總RNA 提取試劑盒購自北京Solarbio 公司；PrimeScript RT 試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix 購自日本Takara 公司；ECL化學發光系統購自美國Thermo Fisher公司。含有sh-H19 或sh-NC 的慢病毒載體購自上海吉凱基因醫學科技股份有限公司。

1.1.3 細胞 SH-SY5Y 細胞購自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所，接種在含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 mg/mL 鏈霉素的DMEM 培養基中培養。

1.2 體內實驗

1.2.1 腦出血模型建立 參照文獻方法通過注射膠原酶Ⅳ誘導腦出血模型［13］。具體操作為：小鼠麻醉后固定在立體定向框架中，并在頭部前囟點（前0.5 mm 和左側紋狀體部分外側2 mm）鉆一個孔。將溶解在0.5 μL 生理鹽水中的總共0.06 單位膠原酶Ⅳ以0.18 μL/min 的速度注射到左側紋狀體中。輸注后將針頭保持原位10 min 以防止回流。

1.2.2 小鼠分組 將小鼠分為6 組：假手術（Sham）組、腦出血（ICH）組、Sham+shRNA 陰性對照（sh-NC）組，Sham+shRNA-H19（sh-H19）組，ICH+sh-NC組和ICH+sh-H19 組。Sham 組（n= 18）：除了不注射膠原酶Ⅳ，其余同1.2.1 方法；ICH 組（n=18）：按照1.2.1 方法建立腦出血模型；Sham+sh-NC 組、Sham+sh-H19 組：在假手術前72 h，分別將含有sh-NC（1 × 108TU/mL）和sh-H19（1 × 108TU/mL）的慢病毒顆粒10 min內緩慢注射到小鼠腦室中（10 μL，速率為0.5 μL/min）；ICH+sh-NC 組、ICH+sh-H19組：在腦出血建模（同ICH 組）前72 h，分別將含有sh-NC（1×108TU/mL）和sh-H19（1×108TU/mL）的慢病毒顆粒10 min 內緩慢注射到小鼠腦室中（10 μL，速率為0.5 μL/min）。體內實驗分為兩部分：（1）腦出血后小鼠腦組織中H19 表達的時程分析：觀察Sham 組和ICH 組腦出血建模術后24、48 和72 h H19 表達水平。（2）確定H19 在腦出血中的作用及其潛在機制：腦出血后48 h，Sham+sh-NC 組、Sham+sh-H19 組、ICH+sh-NC 組和ICH+sh-H19 組每組6 只小鼠被處死并分離病灶腦組織用于后續分析，其余6 只小鼠用于神經行為分析。

1.2.3 病灶體積評估 在神經學評估后，處死模型小鼠并將大腦切成2 mm 厚的冠狀切片，參照文獻方法評估病變體積（n=3）［13］。總病灶體積=4×每個腦切片的病灶體積×2 mm。

1.2.4 行為分析 采用量化改良神經嚴重程度評分（modified neurological severity score，mNSS）評估每只小鼠的神經功能缺損。

1.2.5 免疫熒光 給予腦切片以回收抗原，然后脫水，透化并與0.2%牛血清白蛋白孵育，將腦切片與抗LC3（1∶200）的一抗在4 ℃下孵育過夜。次日，在室溫下將Cy3 標記的山羊抗兔Ig G（1∶200）添加到切片中孵育1 h。然后將切片用DAPI 染色。使用倒置熒光顯微鏡捕獲圖像。

1.3 細胞實驗

1.3.1 細胞分組 將SH-SY5Y 細胞以約1.2 × 106的密度接種至6 孔板中，為了模擬腦出血，將SHSY5Y 細胞暴露于10 μmol/L 濃度下OxyHb［14］。將細胞分為對照（Control）組、H19 敲低組（sh-H19）、OxyHb 組、OxyHb+sh-NC 組、OxyHb+sh-H19 組、OxyHb+sh-Sirt3 組 和OxyHb+sh-H19+sh-Sirt3 組。Control 組：SH-SY5Y 細胞中加入空白溶劑；sh-H19組：采用sh-H19轉染SH-SY5Y細胞48 h；OxyHb組：SH-SY5Y細胞中加入10 μmol/L濃度OxyHb；OxyHb+sh-NC組、OxyHb+sh-H19組和OxyHb+sh-Sirt3組：將sh-NC、sh-H19或sh-Sirt3轉染SH-SY5Y細胞48 h，然后加入10 μmol/L OxyHb處理細胞；OxyHb+sh-H19+sh-Sirt3 組：將sh-H19 和sh-Sirt3 轉染SH-SY5Y細胞48 h，然后，加入10 μmol/L OxyHb 處理細胞。體外實驗分為4 部分：（1）暴露于10 μmol/L 濃度OxyHb的SH-SY5Y 細胞中H19 表達的時程分析：觀察Control 組和OxyHb 組暴露OxyHb 后24、48 和72 h的H19 表達水平。（2）確定H19 敲低對OxyHb 誘導的神經細胞損傷的影響：OxyHb 處理48 h，測定Control 組、OxyHb 組、OxyHb+sh-NC 組和OxyHb+sh-H19 組的細胞凋亡。（3）測定H19 敲低后的SHSY5Y 細胞RNA 序列：Control 組和sh-H19 組在轉染48 h 進行RNA 測序。（4）觀察H19 敲低對Sirt3 介導AMPK/mTOR 信號通路影響：OxyHb 處理48 h，Oxy-Hb組，收集OxyHb+sh-H19組，OxyHb+sh-Sirt3 組和OxyHb+sh-H19+sh-Sirt3組細胞用于信號通路分析。

1.3.2 細胞活力測量 SH-SY5Y 細胞加入MTT 溶液（0.5 mg/mL）并在37 ℃下孵育4 h。然后在黑暗中將紫色晶體溶解在150 μL DMSO 中10 min。在酶標儀上獲得570 nm 處的光密度。

1.3.3 RNA 提取和RT-qPCR 分析 使用總RNA提取試劑盒從腦組織和SH-SY5Y 細胞中提取總RNA。然后使用PrimeScript RT 試劑盒對2 μg RNA樣本進行反轉錄，并在CFX96 實時系統（Bio-Rad）上使用SYBR Green PCR Master Mix 進行RT-qPCR擴增。H19的表達水平標準化為β-actin。使用2-ΔΔCt方法計算倍數變化。本研究中使用的引物如下：H19，F：5'-GGGTGTTTACGTAGACCAGAACC-3'和R：5'-CTTCCAAAAGCCTTCTGCCTTAG-3'；β-actin，F：5'-AATTCCATGGCACCGTCAAG-3'和R：5'-TGGACTCCACGACGTACTC-3'。

1.3.4 免疫印跡分析 通過使用RIPA 裂解緩沖液從組織和細胞中分離總蛋白。蛋白質樣品進行電泳并轉移到PVDF膜上。在5%脫脂牛奶中封閉后，將膜與靶向β-actin（1∶2 000），Beclin（1∶1 000），LC3（1∶1 000），p62（1∶1 000），Sirt3（1∶500），p-AMPK（1∶500）、AMPK（1∶500）、p-mTOR（1∶500）和mTOR（1∶1 000）的一抗在4 ℃下孵育過夜。然后將膜與HRP 偶聯的二抗（1∶5 000）一起溫育1 h，并用ECL 化學發光系統觀察條帶。

1.3.5 Tunel 染色 冷凍切片和細胞使用0.25%Triton X-100 透化15 min。每個切片在室溫下用100 μL 平衡緩沖液孵育20 min，然后用50 μL 重組末端脫氧核苷酸轉移酶（RTdT）孵育緩沖液覆蓋并在37 ℃下黑暗中孵育1 h，再用DAPI 染色15 min。使用倒置熒光顯微鏡捕獲圖像，并對腦出血部位周圍的陽性細胞進行計數。

1.3.6 RNA測序 從SH-SY5Y中提取的RNA（4 μg）用DNase 處理，去除核糖體RNA 后，制備RNA 文庫。在HiSeq 2000 系統（美國Illumina 公司）上進行RNA 測序。使用Bioconductor R 程序中的EBSeq程序包評估差異基因表達。運用注釋、可視化和集成發現數據庫對差異表達的mRNA 進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。

1.4 統計學方法 使用GraphPad Prism 7.0 進行統計分析。計量資料表示為均數±標準差，兩組之間比較用t檢驗，多組比較用方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 H19 在體內和體外腦出血時高度表達 與Sham 組相比，ICH 組在模型建立后第2 天病灶體積顯著增加（P＜0.001），并且mNSS 得分顯著較高（P＜0.001，圖1A-C）。腦出血后H19 的表達呈時間依賴性上調（均P＜0.05，圖1D），并且H19 表達也在OxyHb 處理細胞中以時間依賴性方式增強（均P＜0.05，圖1E）。

圖1 H19 在體內和體外腦出血時高度表達Fig.1 H19 was highly expressed during ICH in vivo and in vitro

2.2 H19敲低減輕腦出血引起的神經損傷 sh-H19顯著降低損傷區域的H19 表達（圖2A）。與ICH+sh-NC 組相比，ICH+sh-H19 組在模型建立后第2 天病灶體積和mNSS 評分均顯著降低（P＜0.01），并且神經元細胞凋亡顯著減少（P＜0.01，圖2B-E）。

圖2 H19 敲低減輕腦出血引起的神經損傷Fig.2 H19 knockdown attenuated ICH-induced nerve damage

2.3 H19 敲低增強腦出血小鼠腦內自噬 損傷區域LC3 的強度因腦出血而增加，而H19 敲低進一步增強了LC3 的強度。見圖3。

圖3 H19 敲低增強腦出血小鼠腦內自噬Fig.3 H19 knockdown enhanced autophagy in the brain of ICH mice

2.4 H19敲低減輕OxyHb誘導的神經細胞損傷誘導腦出血后，細胞中H19 表達升高，并且細胞活力降低（圖4A-B）。由腦出血誘導的凋亡細胞增加被H19 敲低所緩解（圖4C-D）。此外，H19 敲低可增加LC3II/LC3I 和Beclin 水平，降低p62 蛋白水平（圖4E）。

圖4 H19 敲低減輕OxyHb 誘導的神經細胞損傷Fig.4 H19 knockdown attenuated OxyHb-induced neuronal injury

2.5 H19 敲低通過增強Sirt3 介導AMPK/mTOR信號通路促進自噬水平 與對照組相比，H19 敲低組中有1 120 個mRNA 差異表達，其中429 個上調mRNA 和691 個下調mRNA。mRNAs 的差異表達水平通過火山圖直觀表達（圖5A）。KEGG 通路分析顯示，差異表達的mRNA 在AMPK/mTOR 信號通路中富集，這與自噬調節有關（圖5B）。Sirt3 通過AMPK/mTOR 途徑在調節細胞防御和介導細胞存活中發揮重要作用。OxyHb 誘導Sirt3水平升高，H19敲低進一步提高Sirt3水平。在OxyHb 誘導后，p-AMPK/AMPK 比率升高，而p-mTOR/mTOR 比率下降。H19 敲低大大加劇了上述變化（圖5C）。H19敲低細胞中的Sirt3 敲低逆轉了升高的p-AMPK/AMPK 比率和降低的p-mTOR/mTOR 比率（圖5D）。

圖5 H19 敲低通過增強Sirt3 介導AMPK/mTOR 信號通路促進自噬水平Fig.5 H19 knockdown promoted autophagy levels by enhancing Sirt3-mediated AMPK/mTOR signaling pathway

2.6 H19 敲低通過調節Sirt3 誘導的自噬減輕腦出血損傷 H19 敲低細胞中提高的細胞活力在Sirt3 敲低后得到降低，并且減少的細胞凋亡在Sirt3 敲低后得到增強（圖6A-C）。此外，Sirt3 敲低降低了H19 敲低細胞中增加的細胞自噬（圖6D）。

圖6 H19 敲低通過調節Sirt3 誘導的自噬減輕腦出血損傷Fig.6 H19 knockdown attenuated ICH injury by regulating Sirt3-induced autophagy

3 討論

研究表明，H19 在腦出血發展過程中發揮了關鍵作用［15］。H19 可以通過促進miR-675 的表達和靶向VEGF 來增加與腦血管痙攣有關的HIF-1α mRNA 和蛋白質水平。顱內動脈瘤是腦出血的主要原因，H19 通過轉錄和轉錄后調控參與顱內動脈瘤的病理生理過程［9］。此外，H19 也是腹主動脈瘤形成的誘發因素，并通過將SP1 募集到缺氧誘導的因子1α 啟動子區域來促進其轉錄，從而誘導平滑肌細胞凋亡［16］。同樣，ZHANG 等［17］發現H19可以通過Wnt/β-catenin 信號通路充當miR-148b 的分子海綿，從而調節人主動脈血管平滑肌細胞的增殖和凋亡。基于以上證據，本研究通過體內外構建腦出血模型證實了H19 在腦出血小鼠模型中的表達升高，和H19 敲低可以減輕腦出血引起的神經損傷，并在機制研究中發現其損傷機制可能與抑制自噬有關。

大量證據表明，腦出血細胞損傷的嚴重程度受自噬的影響，激活自噬可以通過降解受損蛋白質誘導新蛋白質的合成［18-19］。一些研究者報道，自噬可以減少腦出血后的梗死體積、神經元死亡和神經功能障礙［20］。本研究發現，腦出血損傷期間自噬被激活，并且H19 敲低進一步增加自噬水平。通過mRNA 測序，對照組和H19 敲低組差異表達的mRNA 在AMPK/mTOR 信號通路中富集。AMPK/mTOR 信號通路是自噬過程的經典調控通路，先前研究證實Sirt3 通過AMPK-mTOR 途徑誘導自噬［21-22］。Sirt3 屬于人類sirtuin 家族最保守和最具特征的一個成員，在調節系統大腦中能量穩態和細胞壽命方面起著至關重要的作用［23］。本研究發現H19 敲低增加了Sirt3 水平，并且H19 敲低通過調節Sirt3 誘導的自噬減輕了OxyHb 處理后SH-SY5Y 細胞損傷。因此，筆者認為H19 可能在腦出血模型中通過抑制Sirt3 介導的AMPK-mTOR信號通路來抑制自噬激活。

綜上所述，本研究發現H19 在體內外腦出血模型中以時間依賴性方式增強，H19 敲低可以減少腦出血病灶體積，減輕神經損傷和減少神經元凋亡。此外，H19 敲低促進了Sirt3 的表達，進而通過激活AMPK-mTOR 信號通路增強自噬。這些結果揭示了H19 有可能成為腦出血治療的一個關鍵靶點，這也為開發新的腦出血治療方法提供了基礎。然而，腦出血是一個復雜的調控體系，本課題組后續實驗將進一步闡明H19 是否通過其他途徑介導腦出血進展，并在臨床大樣本中驗證。