黔東南三地大葉韭菜總黃酮含量及抗氧化活性研究

胡秀虹，龍杰鳳，楊勝舟，萬蘭，張海蘭，王曉銘

（凱里學(xué)院，貴州凱里 556011）

韭菜Allium tuberosum屬百合科多年生草本植物，味辛、性溫，有溫中行氣、補虛益陽、散瘀解毒之功效，是中國特有的一種藥食同源的蔬菜［1-3］.研究表明，韭菜中含硫化物、生物堿、揮發(fā)油、黃酮類化合物等多種活性成分［4-6］.大量研究表明［5，7-9］，黃酮類化合物具有抗氧化活性，可用于食品的防腐保鮮［9-10］，還能抑制細胞的凋亡，是治療心血管疾病藥物的主要成分［4，11-12］.

近年來關(guān)于韭菜的化學(xué)成分、藥理學(xué)方面的研究較為深入，對于總黃酮的提取及抗氧化性雖有研究，但多數(shù)是韭菜籽方面的報道.如孫志勇等對韭菜葉及韭菜籽醇提物進行了抗氧化活性研究，結(jié)果顯示韭菜籽及韭菜葉醇提液對DPPH·自由基有很好的清除能力［13］.黃鎖義等發(fā)現(xiàn)，韭菜的黃酮提取物對羥自由基具有很好的清除作用［7］.郭奎彩等［8］研究表明，韭菜籽總黃酮有較強的體外抗氧化作用，能夠有效清除DPPH·和·OH，其IC50分別為0.87 μg/mL和3.33 μg/mL.李敬等研究發(fā)現(xiàn)，韭菜籽總黃酮對DPPH·和·OH 均具有一定的清除作用，最高清除率分別為82.36%和61.20%［9］.

基于此，本文以黔東南苗族侗族自治州麻江、施秉及丹寨三地的大葉韭菜為研究對象，分析比較其總黃酮的含量差異以及不同部位（根和葉）總黃酮含量的區(qū)別，并進一步探究三個地區(qū)的大葉韭菜總黃酮的抗氧化活性，旨在為貴州黔東南州大葉韭菜資源的利用以及天然抗氧化劑的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù).

1 實驗材料、試劑與儀器

1.1 實驗材料與試劑

實驗材料大葉韭菜采集于貴州省黔東南州麻江縣大葉韭菜種植基地、丹寨縣農(nóng)貿(mào)市場和施秉縣農(nóng)貿(mào)市場.

實驗試劑有蘆丁（C≥0.97）、維生素C（C≥0.99）、1，1-二苯肼-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picylhydrazyl，DPPH，C≥0.94），上海源葉生物科技有限公司；亞硝酸鈉、冰醋酸、氫氧化鋁、三氯化鋁、硫酸亞鐵，重慶川江化學(xué)試劑廠；無水乙醇、無水醋酸鈉、過氧化氫、水楊酸，成都金山化學(xué)試劑有限公司.

1.2 實驗儀器

實驗儀器包括UP-6T 優(yōu)普超UP-6T 型超聲波清洗機，上海優(yōu)普實業(yè)有限公司；XFB-500新型密封式粉碎機，吉首市中誠制藥機械廠；FA2004 電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；WGLL-230BE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；BIO-BRI酶標(biāo)儀，成都百樂科技有限公司；BIO-BRI暗箱三用紫外線分析儀，上海嘉鵬科技有限公司；BCD-241TMCN冰箱，青島海爾股份有限公司.

2 實驗方法

2.1 大葉韭菜的前處理

將采集的新鮮大葉韭菜洗凈，根、葉分離，分別置于電熱恒溫干燥箱中45 ℃烘干，粉碎，過60目篩，裝入密封袋，置于干燥器中備用.

2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取5 支試管，按表1 的取量精密量取0.2 mg/mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次加入0.1 mol/L AlCl3溶液和pH 為4.8 的HAc -NaAc 緩沖溶液，60%乙醇溶液定容，搖勻.以60%乙醇溶液作為參比，于40℃水浴反應(yīng)10 min，在407 nm 波長下測定吸光度值，以蘆丁溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖.

表1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)稀釋溶液的配制

2.3 大葉韭菜總黃酮含量測定

稱取大葉韭菜粉末4 g，加80 mL 60%乙醇，超聲波提取30 min，抽濾.濾渣相同條件下二次提取，合并兩次濾液，保存?zhèn)溆?取提取液1 mL，按照2.2 操作，測定其吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得總黃酮濃度，按公式計算總黃酮得率：總黃酮得率（mg/g）=CV/m.式中C為按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算的溶液的總黃酮濃度（mg/mL），V為提取液的體積（mL），m為原料質(zhì)量（4.0316 g）.

2.4 大葉韭菜總黃酮的薄層層析

在硅膠G薄層板鑒別大葉韭菜黃酮類化合物的存在，以乙酸乙酯∶甲醇∶水（8∶3∶1）作為展開劑，以1%AlCl3溶液作為顯色劑于紫外燈下觀察其熒光位置.

2.5 大葉韭菜總黃酮抗氧化活性測定

2.5.1 清除DPPH·自由基能力測定

DPPH 分子式為（H6H5）2·N-NC6H2（NO2）3，是一種很穩(wěn)定的氮中心自由基，其無水乙醇溶液呈紫色，在517 nm 波長處有最大吸收峰，吸光度與濃度呈線性關(guān)系.當(dāng)加入自由基清除劑時，可結(jié)合或替代DPPH·，使自由基數(shù)量減少，吸光度變小，溶液顏色變淺，借此可評價清除自由基的能力.一般清除率越大，抗氧化活性越強.研究表明，黃酮類化合物因含有酚羥基，能與DPPH 反應(yīng)而清除自由基［9，14-15］.

實驗時，按照表2 順序加樣，混勻，超聲處理10 min，于25 ℃水浴恒溫反應(yīng)20 min，無水乙醇凋零，于517 nm 處測定各體系的吸光度A，平行實驗3次，根據(jù)吸光度計算DPPH·自由基清除率，公式如下：DPPH·清除率（%）=［（A2+A3-A1］/A2×100%.式中A1、A2、A3分別為1、2、3反應(yīng)體系反應(yīng)結(jié)束后，517 nm處的吸光度.

表2 清除DPPH自由基的反應(yīng)體系

2.5.2 黃酮清除羥基自由基能力測定

羥基自由基（·OH）清除率是反映藥物抗氧化作用的重要指標(biāo)，采用Fenton 反應(yīng)，利用H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生·OH，加入水楊酸捕捉·OH 自由基并產(chǎn)生有色物質(zhì)2，3-二羥基苯甲酸，該物質(zhì)在510 nm 處有最大吸收.當(dāng)向該反應(yīng)體系中加入具有清除·OH 供能的物質(zhì)，就會減少·OH 的生成，從而使有色物質(zhì)的生成量減少，即溶液的A510nm值降低［7，16］.

實驗時，參照表3依次在比色管中加入相應(yīng)溶液.在510 nm 處測定各反應(yīng)溶液的吸光度，代入如下公式計算羥自由基的清除率：羥自由基清除率（%）=A0-（Ax-Ax0）/A0×100.式中A0為空白對照的吸光度，Ax為樣品溶液的吸光度；Ax0為不加顯色劑（H2O2）的吸光度.

表3 清除羥自由基的反應(yīng)體系

3 結(jié)果與分析

3.1 蘆丁溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

蘆丁溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，由蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖可得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=10.083x+0.137 9，R2=0.998 1，線性關(guān)系良好.

圖1 蘆丁溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 不同地區(qū)大葉韭菜總黃酮的含量

表4 是在黔東南麻江縣、丹寨縣及施秉縣三個地區(qū)于不同時期采集的大葉韭菜總黃酮的含量測定結(jié)果.由表4 可知，麻江縣大葉韭菜葉總黃酮含量均值為6.821～7.215 mg/g，根的為0.485～0.534 mg/g；丹寨縣大葉韭菜葉總黃酮含量均值為6.416～7.049 mg/g，根的為0.361～0.403 mg/g；施秉縣大葉韭菜葉總黃酮含量均值為6.184～7.009 mg/g，根的為0.281～0.339 mg/g.分析實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一地區(qū)的大葉韭菜不同部位（根、葉）的總黃酮含量差別較大，其中韭菜葉總黃酮含量遠大于根所含總黃酮含量.而不同生長時期的大葉韭菜同一部位的總黃酮含量差別較小，且不同地區(qū)的大葉韭菜同一部位的總黃酮含量無顯著差異.

表4 不同地區(qū)韭菜總黃酮含量

3.3 大葉韭菜總黃酮的鑒別結(jié)果

圖2 為大葉韭菜總黃酮提取液的薄層層析鑒別結(jié)果，圖中點樣從左往右分別為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（1號）、高濃度韭菜提取液（2號）及低濃度韭菜提取液（3號）.由圖2可知，三個樣品在薄層板上近同一位置均顯示有相同顏色的斑點.這說明大葉韭菜提取液中含有黃酮類化合物，隨著濃度的升高，斑點顏色越深.此外，相對蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，2、3號樣品的斑點具有明顯的拖尾現(xiàn)象，這主要是因為粗取液可能含有其他類化合物造成.

圖2 韭菜總黃酮的薄層層析圖

3.4 不同地區(qū)大葉韭菜總黃酮清除DPPH·自由基的能力

圖3 為黔東南麻江縣、丹寨縣及施秉縣三個地區(qū)的大葉韭菜（葉）總黃酮提取液對DPPH·自由基的清除率結(jié)果.可以看出，三地韭菜葉總黃酮提取液對DPPH·自由基均有較強的清除能力，隨著濃度的增加，對DPPH·自由基的清除能力逐漸增強，在接近0.01～0.05 mg/mL 時，其DPPH·清除率分別為40.12%～82.15%、36.85%～79.25%和32.58%～75.39%，DPPH·清除率大小順序為麻江＞丹寨＞施秉.

圖3 三地大葉韭菜（葉）總黃酮提取液對DPPH·的清除率

圖4 是三個地區(qū)的大葉韭菜（根）總黃酮提取液對DPPH·的清除率.由圖4 可知，0.01～0.03 mg/L 時，韭菜根總黃酮提取液對DPPH·自由基的清除率很小，隨著濃度逐漸增大，清除率逐漸增大，最大清除率分別為（麻江）37.13%、（丹寨）30.58%、（施秉）23.17%.

圖4 三地大葉韭菜（根）總黃酮提取液對DPPH·的清除率

3.5 不同地區(qū)大葉韭菜總黃酮清除·OH自由基的能力

圖5 是三個地區(qū)的大葉韭菜（葉）總黃酮提取液對·OH 的清除率.實驗結(jié)果顯示，三個地區(qū)的大葉韭菜葉對·OH 自由基的清除能力在0.01～0.05 mg/mL 時，隨著黃酮濃度的增加而增強，其·OH清除率分別為：38.50%～79.17%（麻江）、28.13%～76.13%（丹寨）和26.63%～74.13%（施秉）.

圖5 三地大葉韭菜（葉）總黃酮提取液對·OH的清除率

圖6 為韭菜根對·OH 自由基的清除能力，由圖可知在濃度為0.01～0.06 mg/mL 時，隨著韭菜總黃酮濃度增大，三個地區(qū)韭菜根對·OH 的清除能力隨著增強，·OH 清除率最大的是麻江（56.25%），其次是丹寨（48.35%）和施秉韭菜根（45.68%）.

圖6 三地大葉韭菜（根）總黃酮提取液對·OH的清除率

4 結(jié)論與討論

本研究通過測定分析黔東南三個地區(qū)的大葉韭菜及其不同部位總黃酮含量，得出同一地區(qū)的大葉韭菜不同部位（根、葉）的總黃酮含量差別較大，其中韭菜葉所含總黃酮含量遠遠大于韭菜根所含總黃酮含量.而不同生長時期的大葉韭菜同一部位的總黃酮含量差別較小，且不同地區(qū)的大葉韭菜同一部位的總黃酮含量無顯著差異.實驗數(shù)據(jù)顯示，麻江的韭菜葉總黃酮含量均值為6.821～7.215 mg/g，根的為0.485～0.534 mg/g；丹寨的韭菜葉總黃酮含量均值為6.416～7.049 mg/g，根的為0.361～0.403 mg/g；施秉的韭菜葉總黃酮含量均值為6.184～7.009 mg/g；根的為0.281～0.339 mg/g.據(jù)劉華等［17］報道，采自安順市的細葉韭菜和韭總黃酮含量分別為3.68 mg/g 和0.53 mg/g，與本研究結(jié)果有一定的差別。這說明不同品種韭菜，總黃酮含量也有較大區(qū)別.

此外，研究發(fā)現(xiàn)，大葉韭菜（根、葉）總黃酮提取液對DPPH·和·OH 有一定的清除作用.在接近0.01～0.05 mg/mL 內(nèi)，其清除率隨著提取液總黃酮濃度的增加而增大，反映了其抗氧化能力與總黃酮濃度有關(guān).實驗數(shù)據(jù)表明，黔東南麻江、丹寨和施秉3 個地區(qū)的大葉韭菜（葉）對DPPH·的清除率可高達75.39%～82.15%，對·OH 的最大清除率為74.13%～79.17%；韭菜根對DPPH·的清除率可高達23.17%～37.13%，對·OH 的最大清除率為45.68%～56.25%.這與相關(guān)報道基本吻合［7，11，15］.由此可見，大葉韭菜總黃酮作為一種天然、安全的植物提取物，在食品方面，不僅可作為抗氧化劑、防腐劑等食品添加劑開發(fā)利用，也可應(yīng)用于具有抗氧化及抗衰老作用的功能性食品的研發(fā)；在醫(yī)藥方面，可應(yīng)用于抗菌消炎、止咳平喘、抗腫瘤等藥物當(dāng)中.