茅尾海桐花樹根際土壤來源幾丁質(zhì)降解菌株多樣性及抗植物真菌活性的研究

王巧貞 李鋒 易淑瓊 楊玲 潘信利 黃媛林 李喆 李菲 廖思明 黃庶識,*

(1 廣西科學(xué)院 廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學(xué)重點實驗室，南寧 530007；2 黔南民族師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，都勻5 58000；3 廣西科學(xué)院 廣西近海海洋環(huán)境科學(xué)重點實驗室，南寧 530007；4 廣西科學(xué)院 國家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心，南寧 530007)

幾丁質(zhì)是地球上含量僅次于纖維素的多糖，是一種很好的醫(yī)用生物材料[1-2]。全球每年大約有1012～1014噸的幾丁質(zhì)廢棄物產(chǎn)生，如何處理這些廢棄物是水產(chǎn)養(yǎng)殖與加工業(yè)面臨的主要問題[3]。水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的蝦蟹殼廢棄物是生產(chǎn)高效益產(chǎn)品的原料，可用于生產(chǎn)各種具有生物活性的產(chǎn)品[4]，例如，具有抗菌活性的幾丁質(zhì)降解產(chǎn)物(幾丁質(zhì)寡糖)，可用作食品防腐劑[5]，也被用作水果和蔬菜的保鮮劑涂料，以降低呼吸率達到保鮮的目的[6]。目前，幾丁質(zhì)酶的研究備受關(guān)注，它能將幾丁質(zhì)降解成低聚物，低聚物被N-乙酰氨基己糖苷酶(HEX,EC 3.2.1.52)進一步降解成單體，廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、化學(xué)品和生物燃料等領(lǐng)域[7]。細菌和放線菌是幾丁質(zhì)酶的重要來源，已被鑒別的幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌主要包括Aeromonas、Serratia、Vibrio、Streptomyces和Bacillus等[8]。

幾丁質(zhì)酶(EC 3.2.1.14)屬于糖苷水解酶，通過催化N-乙酰氨基葡萄糖長鏈之間的β-(1,4)糖苷鍵斷裂來發(fā)揮作用[9-10]。幾丁質(zhì)酶可以通過直接降解真菌細胞壁中的幾丁質(zhì)或釋放多糖寡聚物刺激植物的防御體系來抵御病原生物的攻擊[11]，因此幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌也是潛在的農(nóng)用生物防治菌劑。從多種細菌中被分離出來的各類幾丁質(zhì)酶，對引起病害的多種病原菌與害蟲有明顯的抑制作用[12-13]。

紅樹林生境獨特，微生物多樣性豐富，這些微生物可以產(chǎn)生新穎性的活性成分[14-16]，包括來源于幾丁質(zhì)降解菌的幾丁質(zhì)酶。在紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中，底棲生物豐富，多樣性的幾丁質(zhì)降解菌促進了貝類和甲殼類等幾丁質(zhì)生物體的分解，為紅樹林生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)動植物以及微生物提供必要養(yǎng)分，是紅樹林生態(tài)系統(tǒng)食物鏈重要節(jié)點之一，在促進紅樹林生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)物能流動有重要作用。本文以防城港茅尾海紅樹林桐花樹群落中桐花樹根際土壤為研究對象，探討桐花樹根際土壤中可培養(yǎng)幾丁質(zhì)降解菌的多樣性，從中篩選出拮抗植物病原真菌的活性菌株，以期豐富紅樹林土壤來源的農(nóng)業(yè)生防菌資源，為新的生物菌肥開發(fā)奠定基礎(chǔ)。同時，通過檢測微生物基因組中聚酮合酶(polyketide synthetases，簡稱PKSs)基因和非核糖體肽合成酶(nonribosomal peptide synthetases，NRPSs)基因，進一步評價所分離菌株潛在的合成活性次級代謝產(chǎn)物的能力，為研究紅樹林根際土壤來源的幾丁質(zhì)降解菌的生物多樣性及潛在功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基

(1)分離和純化培養(yǎng)基

膠體幾丁質(zhì)的制備，參照文獻[17]：5 g幾丁質(zhì)粉末用30 mL濃鹽酸(35.5%)于4℃浸泡過夜，并在4℃條件下，邊攪拌幾丁質(zhì)膠體邊緩慢加入250 mL預(yù)冷的50%乙醇，充分拌勻，靜置過夜，10000 g離心20 min，收集幾丁質(zhì)膠體，并用無菌水洗滌至幾丁質(zhì)膠體pH為中性。

分離培養(yǎng)基，參照文獻[18]稍做修改：膠體幾丁質(zhì)0.5%，蛋白胨0.1%，NH4Cl 0.01%，KH2PO40.03%，K2HPO40.07%，NaCl 0.01%，F(xiàn)eSO47H2O 0.001%，MgSO47H2O 0.05%，海鹽2.4%，蒸餾水定容至1 L，pH值7.2～7.4，瓊脂1.7%。

(2)復(fù)篩培養(yǎng)基，參照文獻[18]稍做修改：膠體幾丁質(zhì)0.5%，NH4Cl 0.01%，KH2PO40.03%，K2HPO40.07%，NaCl 0.01%，F(xiàn)eSO4 7H2O 0.001%，MgSO4 7H2O 0.05%，海鹽2.4%，蒸餾水定容至1 L，pH值7.2～7.4，瓊脂1.7%。

(3)植物病原真菌培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。

1.1.2 植物病原菌

Boeremia exigua代號C1；芬芳鐮刀菌Fusarium redolens代號C2；藤黑鐮孢菌Fusarium fujikuroi代號C3；腐皮鐮刀菌Fusarium solani代號C4。由廣西科學(xué)院海洋中心李菲提供。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

在廣西茅尾海紅樹林保護區(qū)相距10 km的兩個桐花樹群落采集樣品，樣品信息見表1。

表1 茅尾海紅樹林桐花樹根際土壤樣品信息Tab.1 Information of Aegiceras corniculatum rhizosphere mud in Maowei sea

1.2.2 幾丁質(zhì)降解菌的分離純化

采用梯度稀釋法和劃線法分離純化幾丁質(zhì)降解菌。稱取2 g土壤樣品，裝于50 mL的無菌離心管中，加入18 mL無菌水混勻，于30℃，180 r/min搖床中震蕩30 min，10倍梯度稀釋，制備成原液的10-2、10-3稀釋樣液，并涂布于幾丁質(zhì)篩選培養(yǎng)基上，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)、顏色，挑取形態(tài)、顏色不同的菌落，用連續(xù)平板劃線的方法純化。

1.2.3 PCR擴增和16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析

Chelex-100法[19-20]提取細菌基因組DNA，并以細菌基因組DNA為模板，利用通用引物對27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3')和1492R(5'-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3')進行16S rRNA基因擴增，電泳檢測后，將含有目的條帶的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。結(jié)果序列經(jīng)過軟件BioEdit Sequence Alignment Editor編輯整理，在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(https:// www.ezbiocloud.net/)上在線比對，應(yīng)用MEGA7.0軟件，選取同源性最高的有效菌株的16S rRNA序列，采用鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 幾丁質(zhì)酶活性篩選

用無菌牙簽挑取少量菌體，通過點值法接種在篩選培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)3～7 d。按丁志雯等[18]的方法，通過透明圈觀察法篩選產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株。

1.4 抗植物病原菌活性試驗

抗植物病原菌活性實驗采用平板對峙法，將待試菌株接種在距離PDA平板中心兩側(cè)2.5 cm處，每板接1株細菌，28℃恒溫培養(yǎng)1 d。使用無菌打孔器制備植物病原真菌菌餅(直徑6 mm)，用無菌牙簽挑取菌餅，接種在上述PDA平板的中心位置。空白對照組設(shè)置為只接種植物病原菌的PDA平板，28℃恒溫箱中培養(yǎng)5～7 d，拍照，測量抑菌圈直徑。

1.5 PKS和NRPS基因的擴增及檢測

按照上述方法“1.2.3”提取供試菌株的基因組DNA，在表2中列出了PKS和NRPS基因的擴增引物序列，按照王海強等[21]的方法設(shè)置擴增參數(shù)。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測有無符合條件的目的條帶，記錄結(jié)果。

表2 PKS與NRPS的擴增引物Tab.2 Information of amplifification primer of PKS and NRPS genes

2 結(jié)果與分析

2.1 桐花樹根際土壤中幾丁質(zhì)降解菌的篩選，鑒定與多樣性分析

6份采自茅尾海紅樹林的桐花樹根際土壤樣品，用幾丁質(zhì)分離培養(yǎng)基進行培養(yǎng)分離，并應(yīng)用復(fù)篩培養(yǎng)基通過透明圈觀察法[18]篩選幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌，產(chǎn)酶菌株在復(fù)篩培養(yǎng)基上生長，其菌落周圍能觀察到如圖1所示的透明圈。經(jīng)統(tǒng)計，共獲得73株產(chǎn)酶菌株，根據(jù)菌落形態(tài)和顏色等特征去除重復(fù)菌株，獲得41株菌，經(jīng)16S rRNA基因擴增后進行測序鑒定，與其近緣菌種相似性及其16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見表3和圖2，共鑒定出28個種的細菌及放線菌，隸屬于10目10科的17個屬(表4)，分別為：γ-變形菌綱的產(chǎn)微球莖菌屬(Microbulbifer)、希瓦菌屬(Shewanella)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、腸桿菌屬(Enterobacter)、埃希菌屬(Escherichia)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、Rheinheimera、克雷伯菌屬(Klebsiella)、弧菌屬(Vibrio)；芽胞桿菌綱的微小桿菌屬(Exiguobacterium)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、Priestia、虛構(gòu)芽胞桿菌屬(Fictibacillus)、Cytobacillus；放線菌綱的微桿菌屬(Microbacterium)、谷氨酸棒桿菌屬(Glutamicibacter)及鏈霉菌屬(Streptomyces)。其中26株希瓦菌屬菌株，占所分離菌株的35.62%；13株弧菌屬菌株，占所分離菌株的17.81%，希瓦菌屬為優(yōu)勢菌屬，弧菌屬次之。

圖1 部分幾丁質(zhì)降解菌酶活性Fig.1 Screening results of partial chitinase-producing strains

圖2 基于 16S rRNA基因序列構(gòu)建的neighbor-joining 系統(tǒng)進化樹Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree based on sequences of 16S rRNA gene

表3 28株幾丁質(zhì)降解菌與近緣菌種相似性Tab.3 28 strains of chitin-degrading bacteria similarity with the closely related strains

表4 28株幾丁質(zhì)降解菌的菌屬分布Tab.4 Preliminary screening result of enzyme-producing activities in 28 strains

此外，C98-1與其近緣菌種Microbulbifer pacificusSPO729(T)的相似性為98.44%(表3)；C168與其近緣菌種Vibrio sagamiensisLC2-047(T)的相似性為98.21%，相似性均低于98.65%，可能是潛在新種。

2.2 不同采樣點幾丁質(zhì)降解菌種多樣性分析

在茅尾海紅樹林保護區(qū)相距大約10 km的兩個桐花樹群落采集根際土壤，分離獲得的幾丁質(zhì)降解菌多樣性存在一定差異(表5～6)。1號采樣點表層土壤幾丁質(zhì)降解菌種類最多，包括8個屬10個種，在土壤深度為15和30 cm處的幾丁質(zhì)降解菌種類相對較少；2號采樣點表層土壤的幾丁質(zhì)降解菌種類相對較少，而在15和30 cm深度的土壤分離獲得的幾丁質(zhì)降解菌種類相對較多，均包括5個屬5個種，與1號采樣點種類的分布特征存在差異，推測與兩個采樣點的桐花樹群落的微環(huán)境差異及周圍人類的生活及生產(chǎn)活動相關(guān)。1號采樣點比較遠離人類活動區(qū)域，受干擾相對較少，生物群落結(jié)構(gòu)由于受到擾動少而相對穩(wěn)定，表層土壤自然堆積落葉以及貝類、蝦蟹等含有幾丁質(zhì)的軀殼殘體流失較少，根際土壤幾丁質(zhì)含量相對較高，整個小環(huán)境更有利于幾丁質(zhì)降解菌的生長，這可能是1號采樣點表層土壤的幾丁質(zhì)降解菌種類明顯多于2號采樣點的原因。2號采樣點在逸仙公園附近，該處表層土壤的幾丁質(zhì)降解菌種類相對較少，推測其原因可能是表層土壤的微環(huán)境受到頻繁的人類活動，排水口處生活廢水的沖刷等干擾，造成利于幾丁質(zhì)降解菌生長的營養(yǎng)成分減少，而15和30 cm處土壤受到干擾的程度相對較少，其中的幾丁質(zhì)降解菌種類相對較多。

表5 兩個采樣點桐花樹根際土壤幾丁質(zhì)降解菌的分布Tab.5 Distribution of chitin-degrading bacteria from Aegiceras corniculatum rhizosphere mud of two sampling sites

表6 兩個采樣點幾丁質(zhì)降解菌的種屬差異情況Tab.6 Differences of the chitin-degrading bacteria on species and genus from two sampling sites

2.3 抑菌活性篩選

28株幾丁質(zhì)降解菌分別與4種植物病原真菌進行對峙培養(yǎng)，抑菌結(jié)果顯示，3株Bacillus、1株Cytobacillus和1株Streptomyces表現(xiàn)出不同程度的抑菌效果(圖3和表7)，具體表現(xiàn)為植物病原真菌菌絲無法在幾丁質(zhì)降解菌菌落周圍生長，從而形成大小不一的抑菌圈，抑菌總陽性率為17.86%。其中菌株C157對植物病原真菌C1(Boeremia exigua)和C4(腐皮鐮刀菌，F(xiàn)usarium solani)均表現(xiàn)出顯著的抑制活性(抑菌圈直徑＞10.00 mm)，對其余2種植物病原真菌也表現(xiàn)出一定的抑制活性(抑菌圈直徑＜10.00 mm)；菌株C81-1對植物病原真菌C1(Boeremia exigua)表現(xiàn)出顯著的抑制活性，對其余3種植物病原真菌也具有一定的抑制活性；菌株C202對4種植物病原真菌均表現(xiàn)出顯著的抑制活性；菌株C63和C178對4種植物病原真菌均具有抑制活性，但抑制作用稍弱。

圖3 部分幾丁質(zhì)降解菌對植物病原真菌的抑制效果Fig.3 Inhibitiory effect of the chitin-degrading strains against the plant-pathogenic fungi

表7 5株抑菌活性菌株初篩結(jié)果Tab.7 Preliminary screening result of antifungal activity of the 5 strains

2.4 PKS和NRPS基因的檢測結(jié)果

聚酮化合物和非核糖體肽是微生物產(chǎn)生的重要次級代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌活性等功效[24-25]。抑菌活性結(jié)果表明僅有5株幾丁質(zhì)降解菌對植物病原真菌有抑制活性，為進一步評價28株幾丁質(zhì)降解菌的次級代謝產(chǎn)物生物合成潛能，開展了次級代謝產(chǎn)物聚酮化合物合成酶(PKS)基因和非核糖體肽合成酶(NRPS)基因的PCR檢測。PKS和NPRS基因擴增及電泳檢測結(jié)果顯示，17株幾丁質(zhì)降解菌擴增出了1條以上目的條帶，其中，3株檢測到PKS I基因，15株檢測到PSK Ⅱ基因，1株檢測到NRPS基因。5株具有抗植物病原真菌活性的菌株中只有C202檢測到PKS Ⅰ和PSK Ⅱ基因，其余菌株未檢測到次級代謝產(chǎn)物生物合成基因，研究結(jié)果見表8。

表8 PSK 和NRPS生物合成基因在17株細菌中的分布Tab.8 Distributions of PKS I,PKSII and NRPS genes in 17 strains

3 結(jié)果與討論

在自然界中存在大量的幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌，已報道的降解幾丁質(zhì)的海洋微生物主要為細菌和放線菌，包括弧菌屬 (Vibrio)[8]、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)[26-27]，鏈霉菌屬(Streptomyces)[28]，微球菌屬(Micrococcus)[29]，假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)[30-31]，希瓦菌屬(Shewanella)[32-33]，不動桿菌屬(Acinetobacter)[34]，芽胞桿菌屬 (Bacillus)[35]，產(chǎn)微球莖菌屬(Microbulbifer)[36-37]等。目前，普遍采用透明圈觀察法[38]篩選幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌，膠體幾丁質(zhì)平板呈乳白色半透明狀態(tài)，微生物產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶催化幾丁質(zhì)的β-(1,4)糖苷鍵斷裂，變成水溶性的幾丁質(zhì)寡糖，菌落周圍形成透明圈(圖1)。本研究應(yīng)用幾丁質(zhì)分離培養(yǎng)基對廣西茅尾海紅樹林桐花樹根際土壤來源的細菌進行篩選分離，共獲得28株幾丁質(zhì)降解菌，隸屬于10目10科的17個屬，部分菌屬與前人已經(jīng)研究的幾丁質(zhì)降解微生物重合。人類活動會對土壤中的微生物微生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生影響，劉光榮[39]的研究結(jié)果表明，受到長期人類頻繁活動的干擾，會造成土壤微生物群落結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，群落代謝活性減弱。本文的研究結(jié)果顯示，相距大約10公里的兩個桐花樹群落根際土壤的幾丁質(zhì)降解菌種類的分布特征存在差異，靠近人類活動區(qū)的桐花樹群落根際表層土壤的幾丁質(zhì)降解菌種類相對較少，相反，另一個采樣點離人類活動區(qū)域較遠，其表層土壤的幾丁質(zhì)降解菌種類相對較多，推測與兩個采樣點的桐花樹群落的微環(huán)境差異及周圍人類的生活及生產(chǎn)活動相關(guān)。

本文通過平板對峙法篩選抗植物病原真菌的活性菌株，共有5株幾丁質(zhì)降解菌表現(xiàn)出拮抗作用。其中有4株歸屬于芽胞桿菌科(Bacillaceae)，包括3株芽胞桿菌屬(Bacillus)，1株Cytobacillus屬，也是主要的幾丁質(zhì)降解菌類群。芽胞桿菌是重要的生防菌資源微生物，被廣泛應(yīng)用于土壤難溶化合物降解、植物病蟲害防治等方面[40]，Essghaier等[8]發(fā)現(xiàn)的1株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的耐鹽地衣芽胞桿菌能顯著抑制鐮刀菌屬病原真菌。海洋放線菌被認為是具有巨大應(yīng)用前景的生物酶資源庫，其產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶具有顯著的抗菌活性[41]，Chenyin等[25]從鏈霉菌Streptomyces alfalfae中克隆并在大腸桿菌中表達的幾丁質(zhì)酶SaChiB對灰葡萄孢菌和禾谷鐮刀菌等6種病原真菌具有強抑制活性，可作為防治植物病原真菌的生物防治劑。其他細菌如弧菌屬[42]和假單胞菌屬(Pseudomonas)[43]等微生物產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶也被報道具有拮抗致病性真菌的作用。一方面，微生物來源的幾丁質(zhì)酶可以削弱和降解許多害蟲和病原體的細胞壁，從而表現(xiàn)出抗細菌、抗真菌、殺蟲或殺線蟲的活性[44-45]，在農(nóng)業(yè)生物防治方面具備應(yīng)用潛力；另一方面，經(jīng)過幾丁質(zhì)酶處理制備獲得的幾丁寡糖、N-乙酰氨基葡萄糖及其各類衍生物，具有抗真菌、降血脂、抗腫瘤等多種功能，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等行業(yè)應(yīng)用廣泛[46]。

微生物PKS型和NRPS型生物合成基因編碼的聚酮化合物合成酶(polyketide synthetases，簡稱PKSs)和非核糖體肽合成酶(nonribosomal peptide synthetases，簡稱NRPSs)分別催化合成聚酮化合物和非核糖體肽，這兩大類次級代謝產(chǎn)物具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌等生物活性[24-25]，常被用作抗生素、抗癌制劑和免疫抑制劑等[47]。17株幾丁質(zhì)降解菌檢測到PKS型和/或NRPS型生物合成基因，但只有菌株C202表現(xiàn)出顯著的抗植物病原真菌活性，C202的抗菌活性可能是PKS型生物合成基因表達并合成的聚酮化合物的作用，也可能是其所分泌幾丁質(zhì)酶的降解作用，還有可能是兩種因素的協(xié)同作用，其抗菌機理有待進一步深入研究。其余16株未表現(xiàn)出抗菌活性，究其原因，可能是菌株在植物病原真菌培養(yǎng)基(PDA)上培養(yǎng)，大部分細菌的基因簇是沉默的，也可能是這些細菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)產(chǎn)物產(chǎn)量太低無法達到抑制效果，抑或是這些微生物合成的活性物質(zhì)無法抑制文中所述的4種植物病原真菌的生長。此外，菌株C63、C81-1、C157和C178對4種植物病原真菌均具有拮抗作用，但未檢測到上述的3類生物合成基因，推測其抑菌活性可能與其菌株產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶有關(guān)。

紅樹林特殊的生態(tài)環(huán)境，蘊藏著豐富的微生物資源，棲息其中的微生物物種、遺傳和功能多樣性有待挖掘，本論文不僅對紅樹林根際土壤產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的微生物資源進行探索，也開展了抗植物病原真菌生物農(nóng)業(yè)的研究，相關(guān)研究結(jié)果對幾丁質(zhì)的資源化利用和新型生物農(nóng)藥發(fā)現(xiàn)提供了參考，也為今后實現(xiàn)海洋微生物資源的高賦值開發(fā)利用提供了研究基礎(chǔ)。