錫林郭勒盟高原鹽湖放線菌資源勘探及抗菌活性篩選

趙思捷 王春苗 王聰聰 李甲 鄭文 張璐 岳澤惠 李小俊,*

(1 河北北方學院醫學檢驗學院，張家口 075000；2 河北北方學院附屬第一醫院，張家口 075000)

放線菌具有無與倫比的代謝多樣性，很多臨床使用的抗生素和應用于其他領域的天然藥物均來自放線菌[1]。基于普通生態環境藥用放線菌資源的反復挖掘及其次級代謝產物的重復篩選已成為新抗生素發現的瓶頸問題之一，向特殊生態環境尋找產生新抗生素的放線菌資源已成為抗生素研發的一個熱點。

鹽湖是一種高鹽生境，隸屬于內陸咸水，是不同于海洋的一類水體。鹽湖的水體受降水量的持續減少可變成干涸湖盆，這也歸屬于鹽湖的范疇。在我國，鹽湖通常指的是鹽度＞3.5%的湖泊[2]，主要分布在西部和北部干旱地區，可劃分為4個鹽湖區：青藏高原鹽湖區(Ⅰ)、西北鹽湖區(Ⅱ)、中北鹽湖區(Ⅲ)和東部分散鹽湖區(Ⅳ)，每個鹽湖區又可劃分為不同的亞區[2]。

鹽湖蘊藏著豐富及特殊的放線菌資源，據我們對《International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology》和《Antonie Van Leeuwenhoek》這2本刊登放線菌新物種的權威雜志開展的不完全統計，2012—2021年至少已發表34個鹽湖放線菌新種，含有效命名新種30個(https://www.bacterio.net/)。近年來，從鹽湖樣品中篩選出了多株具有抗菌、抗腫瘤、抗植物病原真菌等廣泛生物活性的菌株，新的次級代謝產物也被陸續發現[3-4]。我國鹽湖放線菌資源研究較早、較多的是以新疆鹽湖為代表的Ⅱ區和以青海、西藏鹽湖為代表的Ⅰ區，如羅布泊鹽湖[5]、艾丁湖[6]、硝爾庫勒湖[7]和青海湖[8]等，近年來，也有關于我國通遼嫩江鹽湖亞區(Ⅳ1)[9]放線菌資源的報道。

我國鹽湖Ⅲ2亞區主要包括內蒙古錫林郭勒盟的高原鹽湖和河北省張家口境內的九蓮城淖爾和察汗淖。Ⅲ2亞區鹽湖含鹽量高，有的已形成鹽堿沙化的干涸湖盆。該區域氣候寒冷、干旱多風且輻射強，諸多的特境因子，使其成為挖掘珍稀藥用放線菌資源的理想區域之一。本研究前期對九蓮城淖爾放線菌資源勘探的結果曾提示該亞區鹽湖放線菌多樣性、新穎性較豐富，值得研究[10]。本論文進一步選擇Ⅲ2亞區錫林郭勒盟的高原鹽湖，以分布其中的不同鹽湖沉積物和土壤樣品為研究對象，分離其中的放線菌，以期獲得新穎、稀有及具有抗菌活性的放線菌菌株，為鹽湖新型抗菌活性次級代謝產物的發現儲備藥用放線菌菌種資源，同時，為全面了解和掌握我國鹽湖Ⅲ2亞區放線菌物種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

2×EasyTaqSuperMix、pEASY-T1 Cloning kit等細菌16S rRNA基因PCR擴增及克隆相關試劑(北京全式金生物技術有限公司)，Chelex-100樹脂(Bio-Rad公司)，萘啶酮酸(Alfa Aesar公司)，放線菌酮(Aladin公司)，Mueller-Hinton(M-H)培養基、酵母粉(Oxoid公司)，R2A培養基、高氏一號培養基(北京奧博星生物技術有限責任公司)。

1.1.2 放線菌分離培養基

M1(甘油無機鹽培養基，g/L)：甘油10，NH4Cl 1.0，NaNO31.0，MgSO4·7H2O 0.2，FeSO4·7H2O 0.001，Na2HPO40.21，NaH2PO40.09，KCl 0.04，CaCl20.015；M2：海藻糖-肌酸培養基[11]；M3：PYG培養基[12]；M4：高氏一號培養基；M5：10%營養瓊脂[13]；M6(丙酸鈉無機鹽培養基，g/L)：丙酸鈉2.0，NH4NO30.1，KCl 0.1，MgSO4·7H2O 0.05，FeSO4·7H2O 0.05，添加復合維生素[10]1 mL/L；M7：改良ISP 2培養基[10]；M8：改良淀粉脯氨酸培養基[14]；M9：改良纖維素酪素培養基(CCMS)[15]；M10：R2A培養基；M11：CMKA培養基[16](10%NaCl)；M12：高氏一號培養基(5%NaCl)；M13：改良甘油精氨酸培養基[10](5%NaCl)；M14：改良淀粉酪素培養基[17](10%NaCl、1%KCl和1%MgCl2)；M15：GW1培養基[18](5%NaCl)；M16：十分之一Gibbson培養基[19](8%NaCl)；M17：MM培養基[18](5%NaCl)。M18：AGG培養基[18](12%NaCl)；M19：GFA培養基[18](5%NaCl)；M20：改良ISP 5培養基[17](3%NaCl)。每種分離培養基添加抑制劑的種類、濃度及方法參照文獻[10]。

1.1.3 指示菌

金黃色葡萄球菌ATCC25923，糞腸球菌ATCC 29212，大腸埃希菌ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC 27853，肺炎克雷伯菌ATCC10031，鮑曼不動桿菌ATCC 19606。臨床耐藥株包括：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌18060304，糞腸球菌19030640，大腸埃希菌19031919，銅綠假單胞菌19031218，肺炎克雷伯菌18060312，鮑曼不動桿菌18060517，均來自河北北方學院附屬第一醫院菌株，保存于河北北方學院病原生物學實驗室。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集與處理

共采集了錫林郭勒盟東烏珠穆沁旗(東烏旗)、阿巴嘎旗、二連浩特、蘇尼特左旗(東蘇旗)鹽湖、鹽池及鹽堿灘的沉積物及土壤樣品，每個采樣區域采集3～5份樣品。每個采樣區域的3～5份樣品合并為一個樣品，用于放線菌的分離，編號為S1～S7，樣品信息(表1)。樣品分別裝入50 mL無菌離心管，運抵實驗室后自然風干，研磨成粉末狀備用。

表1 錫林郭勒盟采集的樣品信息Tab.1 Sample information collected from Xilin Gol League

1.2.2 放線菌的分離與純化

分別稱取2 g風干樣品至18 mL溶液A (g/L，NaCl 7.5，KCl 0.1，CaCl20.1，NaHCO30.2，焦磷酸鈉1.0，酵母粉 60.0)[10]中，28℃ 180 r/min搖床振蕩1 h水合混勻；然后用無菌水連續進行兩次10倍稀釋；分別吸取10-2g/mL、10-3g/mL稀釋液150 μL涂布于20種分離培養基上，28℃恒溫培養。觀察各培養基上單菌落的長出情況，初步記錄不同培養基的分離效果。根據單菌落形態排重，挑取典型放線菌單菌落和細菌形態疑似放線菌單菌落，于改良ISP 2瓊脂平板分區劃線進行純培養。純培養物再次根據菌落或菌苔形態排除重復后，依次編號。對編號菌株拍攝菌落照片存檔、留存菌種并進行分子鑒定。

1.2.3 放線菌的分子鑒定

菌株DNA的提取采用Chelex-100法[20]。16S rRNA基因PCR擴增的引物、擴增體系和反應條件參照文獻[10]。PCR陽性結果由生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序。測序結果利用EzTaxon服務器(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)進行16S rRNA基因相似性的比對，確定菌株的種屬類別。根據文獻[10]，對潛在放線菌新種進行16S rRNA基因的克隆，獲得近乎全長的序列，進一步比對獲得更精準的16S rRNA基因相似值。根據文獻方法[10]，構建鏈霉菌新種基于16S rRNA基因的系統發育樹。

1.2.4 功能基因(PKS I、PKS II和NRPS)的檢測

根據菌屬類別和新穎性，挑選代表菌株進行抗生素生物合成基因的檢測，包括I型聚酮合酶(PKS I)和II型聚酮合酶(PKS II) KS域基因，非核糖體多肽合成酶(NRPS) A結構域基因。根據文獻[10]，設計PCR引物、擴增體系及反應條件。

1.2.5 菌株的發酵及抗菌活性篩選

對選取的代表菌株進行抗菌活性的檢測。根據菌株生長特點，選擇改良ISP 2或改良ISP 2 (添加5%NaCl)作為搖瓶發酵培養基。采用與文獻[10]相同的菌株發酵條件及其次級代謝產物的提取方法。每株受試菌株留存3類樣品：①發酵液離心后的上清原液；②上清乙酸乙酯萃取后的甲醇濃縮物；③菌體的丙酮浸提濃縮物。

含有代謝產物藥敏紙片的制備參照文獻[10]。采用K-B法藥敏試驗[21]檢測對12個指示菌的抗菌活性。綜合每個代表菌株3類代謝產物樣品對病原菌標準菌株和臨床分離株的活性進行統計。

1.2.6 目標菌株基因組序列antiSMASH在線預測與分析

綜合菌株的新穎性和抗菌活性信息，對篩選出的目標菌株進行基因組測序。目標菌株選擇適宜培養基于28℃、180 r/min搖瓶震蕩培養5～7 d，發酵液4500 r/min離心20 min，收集菌體并用無菌水洗滌3次，然后裝入15 mL離心管，液氮速凍后置-80℃保存。干冰條件寄送至深圳華大基因股份有限公司完成基因組的提取、測序、組裝和注釋。基因組序列通過antiSMASH服務器(https://antismash.secondarymetabolites.org/)進行次級代謝生物合成基因簇的預測。

2 結果

2.1 可培養放線菌的多樣性

本實驗分離獲得了365株放線菌，隸屬于放線菌綱的8個目15個科28個屬(表2)，其中鏈霉菌屬和擬諾卡菌屬為優勢菌屬，分別分離得到146株和92株，占分離菌株總數的40.0%和25.2%。365株放線菌中，170株分離自含鹽培養基M11～M20，分布于16個屬。

表2 365株放線菌的菌屬分布Tab.2 The genera distribution of 365 actinomycete isolates

20種分離培養基中，從M4(高氏一號培養基)、M7(改良ISP 2)、M15(GW1)和M20(改良ISP 5)分離所得的菌株數量和菌屬種類較多(圖1a)；從M2 (海藻糖-肌酸培養基)、M5 (10%營養瓊脂)、M10 (R2A)、M12 (高氏一號培養基+5%NaCl)和M16 (十分之一Gibbson培養基)分離所得菌屬種類也較多；而M18(AGG培養基)、M17(MM培養基)、M1(甘油無機鹽培養基)、M19(GFA培養基)和M14(改良淀粉酪素培養基)分離獲得的菌屬種類較少。在7份樣品中，從S4 (查干淖爾鹽湖邊土樣)、S6(二連鹽湖表層及表層下5～15 cm土樣)和S2 (烏拉蓋高壁邊緣土樣)中分別分離獲得了14、13和9個不同菌屬的放線菌(圖1b)；而S3 (額吉淖爾沉積物樣品)和S5 (二連鹽湖表層下15～20 cm土樣)分離得到的放線菌較少。

圖1 不同培養基(a)和樣品(b)分離所得放線菌的數量及菌屬分布Fig.1 The quantity and genera distribution of actinomycete isolates from different media (a) and samples (b)

2.2 可培養放線菌的新穎性

本研究所分離鏈霉菌中，33株與近緣菌株16S rRNA基因的最高相似度低于98.65%[22](推薦細菌新種的標準)，初步判斷其隸屬于20個鏈霉菌屬新種；其中13株顯示≤98.0%的相似度，推測其隸屬于10個鏈霉菌屬新種(表3)。比對結果提示，菌株XMNu-295和XMNu-232與近緣菌株最高相似度僅分別為97.1%和97.3%；XMNu-135、XMNu-269和XMNu-281具有相同的16S rRNA基因，共同歸屬于鏈霉菌屬的一個新種；XMNu-215和XMNu-257具有相同的16S rRNA基因，共同歸屬于另一個鏈霉菌屬新種；菌株XMNu-361雖然與XMNu-215、XMNu-257擁有相同的近緣菌株S.lopnurensisTRM 49590T，但與XMNu-215、XMNu-257間16S rRNA基因的相似度低于98.0%，所以，XMNu-361單獨代表一個鏈霉菌屬新種；XMNu-217、XMNu-314和XMNu-422分別單獨代表鏈霉菌屬不同的新種；以上13株菌中，11株已克隆獲得近乎全長的16S rRNA基因，這11株鏈霉菌與近緣菌株基于全長的16S rRNA基因構建的系統發育樹見圖2。

圖2 11株新穎鏈霉菌與近緣菌株基于16S rRNA基因構建的鄰接法系統進化樹Fig.2 The Neighbour-joining tree showing the phylogenetic relationships between 11 novel Streptomyces isolates and related type strains based on 16S rRNA gene sequences

表3 錫林郭勒盟高原鹽湖分離獲得的新穎菌株Tab.3 The novel strains isolated from saline lakes in Xilin Gol Plateau

所分離稀有放線菌中，XMNu-373、XMNu-417、XMNu-419、XMNu-425和XMNu-433 (表3)共同代表Phytoactinopolyspora屬一個新種，XMNu-373作為模式菌株已被有效命名為Phytoactinopolyspora mesophila[23]。此外，還發現2個疑似壤霉菌屬(Agromyces)新種、2個疑似擬諾卡菌屬(Nocardiopsis)新種和1個疑似鏈單孢菌屬(Streptomonospora)新種(表3)。

2.3 放線菌抗生素生物合成基因檢測結果

根據菌屬類別和新穎性，對32株鏈霉菌、38株稀有放線菌(含14株擬諾卡菌)進行了PKSⅠ、PKSⅡ、NRPS功能基因的檢測。PCR結果顯示30株鏈霉菌、14株擬諾卡菌和20株其他稀有放線菌至少含有3種功能基因的一種(表4)，20株同時含有三種功能基因，PKSⅠ陽性29株，PKSⅡ陽性45株，NRPS陽性44株(圖3)。

圖3 70株代表菌株PKS I、PKS II、NRPS基因陽性菌株數量Fig.3 Positive results of screening on PKS I,PKS II and NRPS genes in 70 representative isolates

表4 PKSⅠ、PKSⅡ和NRPS基因篩選陽性結果Tab.4 Positive results of screening on PKSⅠ,PKSⅡ and NRPS genes

2.4 抗菌活性檢測結果

由于部分菌株搖瓶長勢較差，只對70株代表菌株中的32株鏈霉菌、13株擬諾卡菌和17株其他稀有放線菌完成了抗菌活性篩選。結果提示這些放線菌對革蘭陽性菌的抗菌作用優于革蘭陰性菌，19株鏈霉菌、9株擬諾卡菌和7株其他稀有放線菌對金黃色葡萄球菌具有抗菌活性；19株鏈霉菌、2株擬諾卡菌和1株小單孢菌(Micromonospora)對糞腸球菌具有抗菌活性。具有抗菌活性的其他稀有放線菌包括Agromyces、Kocuria、Microbacterium、Nocardia和Phytoactinopolyspora屬各1株。鏈霉菌XMNu-116、XMNu-202和XMNu-297抑菌圈較大且抗菌譜較廣(抗金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和鮑曼不動桿菌)(表5和圖4)。

圖4 部分放線菌代表菌株K-B法抗菌活性結果Fig.4 The antibacterial activities of partial representative actinomycete strains in disk diffusion tests

表5 部分放線菌代表菌株的抗菌活性Tab.5 Antibacterial activities of partial representative actinomycete strains

2.5 鏈霉菌XMNu-295次級代謝產物合成潛力分析

鏈霉菌XMNu-295是本研究中發現的最新穎的一株放線菌，且該菌株對金黃色葡萄球菌和糞腸球菌具有抗菌活性。因此，基于基因組信息對該菌株合成次級代謝產物的潛力進行預測。菌株XMNu-295基因組全長9.9 Mbp，G+C含量為69.4 mol%。經antiSMASH預測分析，其潛在的次級代謝產物生物合成基因簇(biosynthetic gene cluster，BGC)共有24個(表6)，主要包含聚酮類(T1PKS、T2PKS和T3PKS)、非核糖體多肽類(NRPS)、萜烯類(terpene)、羊毛硫肽類(lanthipeptide)和嗜鐵素(siderophore)等已知基因簇。其它未匹配到同源基因簇的序列，提示屬于塞克肽類(ranthipeptide)、非α-多聚氨基酸類(NAPAA)和核糖體合成和翻譯后修飾肽(RiPP-like)基因簇。

表6 XMNu-295次級代謝產物生物合成基因簇Tab.6 Secondary metabolite biosynthesis gene clusters of XMNu-295

3 討論

本研究分離獲得了隸屬于28個屬的365株放線菌，其中170株分離自含鹽(3%～12%)培養基，分布于16個屬，顯示錫林郭勒盟高原鹽湖可培養放線菌群落多樣性較豐富，也間接地反映出分離培養基達到了一定分離效果。本研究選擇的分離培養基達20種，目的是期望能夠分離更多不同代謝類型和不同菌屬的放線菌。這些培養基涵蓋：放線菌經典培養基，如M4(高氏一號培養基)和M7(改良ISP 2)；寡營養培養基，如M1(甘油無機鹽培養基)、M6(丙酸鈉無機鹽培養基)、M10(R2A)和M16(十分之一Gibbson培養基)等；添加了細胞滲透調節物質(海藻糖、甘露醇、甜菜堿和脯氨酸)的培養基，如M2(海藻糖-肌酸培養基)、M3(PYG)、M5(10%營養瓊脂)、M11(CMKA培養基)、M15(GW1培養基)、M19(GFA培養基)和M20(改良ISP 5)。分離結果也進一步證實，M4、M7、M15、M20、M2、M5、M10、M12和M16分離效果相對較好(培養基按分離到的菌屬種類和菌株數量綜合排序，圖1)。

本研究中CMKA、AGG和改良淀粉酪素培養基分離得到的菌屬種類和菌株數量少，可能與這3種培養基添加的鹽濃度 (≥10%)較高有關；而且本研究中僅有的1株糖多孢菌(Saccharopolysporasp.XMNu-341)、1株鏈單孢菌(Streptomonosporasp.XMNu-383)和2株糖單孢菌(Saccharomonosporasp.XMNu-293和XMNu-366)分離自GW1、AGG和CMKA培養基。所以，這些培養基在鹽湖放線菌的分離中是不能被忽視的。此外，這幾種培養基分離獲得的菌屬種類也與關統偉等對新疆高鹽環境放線菌的分離結果存在一致性[16,18]。

本研究獲得的33株新穎的鏈霉菌推斷歸屬于20個鏈霉菌屬新種，占所分離鏈霉菌的22.6%，相較于同屬于Ⅲ2鹽湖亞區的九蓮城淖爾[10]新穎性更為突出，這些菌株的獲得為鹽湖來源藥用菌株的開發積累了菌種資源。兩株新穎的鏈霉菌XMNu-295和XMNu-232對金黃色葡萄球菌和糞腸球菌具有抗性但活性不強；新穎鏈霉菌中，抗菌作用最突出的是XMNu-116、XMNu-202和XMNu-297(表3、5和圖4)。這五株鏈霉菌作為本研究發現的目標菌株，將進一步用于開展多相分類學或次級代謝產物相關的化學研究。

當前，從具有強選擇因子(如高鹽、高溫、低溫和強輻射等)而又低度開發的生態環境中篩選新的或稀有放線菌資源已成為新化合物發現的一種備選策略[24]。此外，近年來，隨著基因組挖掘的深入，大量未被探索的沉默次級代謝產物生物合成基因簇被發現，這提示鏈霉菌基因組是新藥發現的寶貴資源[25]。因此，本研究首先對新穎鏈霉菌XMNu-295的基因組信息進行了挖掘。菌株XMNu-295基因組中預測出24個BGC(表6)，其中10個BGC(含4個100%匹配的基因簇albaflavenone、alkylresorcinol、四氫嘧啶ectoine和scabichelin)與已有基因簇相似度較高(＞70%)，3個BGC與已有基因簇具有中度相似值(30%～70%)，這表明菌株XMNu-295可能能夠產生這些化合物或其類似物；7個BGC與已有基因簇具有低度相似值(＜30%)，4個BGC未匹配到同源基因簇，這些隱性BGC的存在暗示菌株XMNu-295有產生新抗生素的潛力。后期將繼續對這些目標菌株XMNu-232、XMNu-116、XMNu-202和XMNu-297開展基因組信息的挖掘，并進一步開展抗菌活性代謝產物的化學研究。

綜上所述，本研究從我國鹽湖Ⅲ2亞區的錫林郭勒盟高原鹽湖中分離獲得了新穎、稀有及具有抗菌活性的放線菌菌株，為鹽湖新型抗菌活性次級代謝產物的發現儲備了藥用放線菌資源，為全面了解和掌握Ⅲ2鹽湖亞區放線菌物種了奠定了基礎。