WAP-8294A類抗生素及其高效合成的研究進展

白先平 陳漢娜 鐘林 王邢艷 卞小瑩

(山東大學微生物技術國家重點實驗室，山東大學-亥姆霍茲生物技術研究所，青島 266237)

多重耐藥細菌病原體的不斷出現對人類健康構成了重大威脅，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA)引起的感染已成為一個非常嚴重的臨床問題[1-3]。在過去的幾十年里，萬古霉素被認為是治療MRSA感染的最后手段，但由于MRSA對這種藥物的敏感性降低以及在治療菌血癥、心內膜炎上的臨床失敗[4-5]，人們迫切需要開發新型抗生素及治療策略[6-8]。

非核糖體多肽合成酶(nonribosomal peptide synthases,NRPSs)是一類結構獨特且功能多樣的多模塊巨型酶，能夠對底物氨基酸進行特異地選擇并按照共線性規律合成非核糖體多肽(nonribosomal peptides,NRPs)。每個模塊通常包含3個必需結構域：腺苷酰化(adenylation,A)結構域、肽酰載體蛋白(peptidyl carrier protein,PCP)和縮合(condensation,C)結構域，負責將特定的單體縮合到新生成的肽鏈上[9-10]。其中某些線性或環狀聚肽骨架的N端帶有脂肪酸鏈，稱為非核糖體脂肽(nonribosomal lipopeptides,NRLPs)，該脂肪酸鏈可進入細菌細胞膜的磷脂雙分子層，通常具有廣泛的生物活性[11]。

WAP-8294A類抗生素是含有四十元環的脂肽類抗生素，由非核糖體多肽合成酶NRPSs負責編碼合成，主要產物有WAP-8294A1、WAP-8294A2和WAP-8294A4[12]。其中，WAP-8294A2(lotilibcin) 對于 MRSA的抗菌效果能達到萬古霉素的14倍，目前已進入臨床I期試驗階段[13]。溶桿菌屬(Lysobacter)屬于溶菌科(Lysobacteraceae)中的一類革蘭陰性細菌，廣泛存在于土壤和水生環境中。1978年，Christensen和Cook首次描述了Lysobacter[14]，Park等[15]于2008年對其進行了修訂。目前，該屬大約有85種(https://lpsn.dsmz.de/)，其中超過22種菌株的基因組已公開。在過去的10年中，該屬已成為一類新的生物防治劑，用于對抗作物病原體，并作為一種新的裂解酶和抗菌天然產物來源而被廣泛研究[16-17]。例如，L.enzymogenesOH11能夠生產具有廣譜抗真菌和抗細菌活性的新型農業生物防治劑HSAF[18]和WAP-8294A類抗生素[19]；L.enzymogenesC3代謝產物對多種真菌病原體具有田間藥效[20-21]。

1 WAP-8294A的起源及生物合成

1.1 WAP-8294A的起源

1997年，Kato等[22]在日本靜岡下田收集的土壤樣品中分離出溶桿菌(Lysobactersp.)，并在含有葡萄糖、大豆粉、氯化鈉和碳酸鈣的發酵培養基中30℃培養3 d，分離出白色無定形粉末化合物WAP-8294A2。1998年，他們優化條件后成功分離出WAP-8294A復合物A1、A2、A4、Ax8、Ax9、Ax13(圖1)。

圖1 WAP-8294A主要產物結構[22]Fig.1 Structures of major products of WAP-8294A[22]

2011年，該課題組又利用ESI-MS與MS/MS聯用技術確定了微量組分多肽的氨基酸序列[23]，WAP-8294A1的結構組成是FA-L-Ser1-D-OHAsn2-L-Ser3-Gly4-N-Me-D-Phe5-Leu6-D-Orn7-L-Glu8-D-Asn9-DTrp10-D-Orn11-N-Me-L-Val12。WAP-8294A1和A4具有與A2相同的氨基酸序列，區別在于A1和A4分別具有3-羥基-辛酸(3-OH-octanoic acid)和3-羥基-8-甲基-壬酸(3-OH-8-Me-nonanoic acid)脂肪酸鏈，而A2中的脂肪酸鏈是3-羥基-7-甲基-辛酸 (3-OH-7-Me-octanoic acid)；除此之外，A2結構中的Gly4在Ax13中變成了β-Ala4。

1.2 WAP-8294A的生物合成

L.enzymogenesOH11的基因組序列已于2011年完成測序，該基因組中含有大量的天然產物生物合成基因簇，包括WAP-8294A(指定為WAPS；登錄號JN596952)。WAPS由NRPSs編碼，共含有10個開放閱讀框(open reading frame,ORF) 其中ORF 2和ORF 3編碼核心NRPS(WAPS1和WAPS2)；WAPS1共含有7個模塊，25個結構域，WAPS2包含5個模塊，20個結構域，負責WAP-8294A2中12個氨基酸的識別、激活、硫醇化、縮合和修飾，同時該基因簇中富含差向異構酶(epimerase,E)結構域，意味著其產物富含D-氨基酸。

WAPS1以C結構域(CIII型)開頭，這是環狀脂肽NRPS中常見的特征，如表面活性劑(surfactin)[24-25]、達托霉素(daptomycin)[26-27]和鈣依賴性抗生素(calciumdependent antibiotic,CDA)[28-29]。Surfactin的N端也被3-羥基脂肪酸酰化，該脂肪酸鏈與肽鏈的C端羧基形成內酯，而在daptomycin與CDA中，N端被非羥基化的脂肪酸酰化，環化發生在C端的羧基與內部氨基酸(Thr)的羥基之間。另外，ORF1編碼MbtH-like蛋白，某些A結構域依賴于與MbtH樣蛋白的相互作用來維持其正確的構象或催化活性，是生物合成所必需的；ORF4編碼雙加氧酶，可能負責羥基化的形成；ORF5負責外輸轉運；ORF8編碼TonB依賴性受體；ORF6、ORF7、ORF9和ORF10屬于自身保護基因(圖2)。

圖2 L.enzymogenes OH11的WAP-8294A生物合成基因簇[19]Fig.2 The WAP-8294A biosynthetic gene cluster of L.enzymogenes OH11[19]

2011年，Zhang等[19]通過基因組挖掘、目標特異性基因失活、代謝物分離和結構闡明等一系列實驗分析并提出了 WAP-8294A2的生物合成途徑(圖3)，為 WAP-8294A2生物合成機制的研究奠定了基礎。

圖3 L.enzymogenes OH11中WP-8294A類產物的生物合成途徑[19]Fig.3 Biosynthetic pathway for WAP-8294A2 products from L.enzymogenes OH11[19]

首先通過酰基CoA連接酶(Acyl-CoA ligase,ACL)來激活3-羥基脂肪酸，這一步可能由WAPS1的起始縮合結構域(condensation starter,Cs)負責將酰基鏈引入到肽鏈中，而WAPS1中編碼的7個模塊分別激活L-Ser1、L-Asn2、L-Ser3、Gly4、L-Phe5、L-Leu6和L-Orn7，其中模塊2、5、7中的L-氨基酸在E結構域的作用下，異構化為相應的D-氨基酸。模塊5中的甲基轉移酶(methyltransferase,MT)負責在Phe的氨基氮上加上一個甲基。L-Asn2的羥基化也位于β位，可能是由雙加氧酶 (ORF4)來完成的，這一步是WAP-8294A2合成所必需的。

值得注意的是模塊2中的A結構域對底物的識別具有一定的寬泛性，它既可以識別Asn，也可以識別β-OH-Asn。WAPS2第一個模塊中的C結構域開始，負責催化將上游的七肽鏈與WAPS2第一個PCP結構域上的Glu8進行縮合。模塊9、10、11中都包含一個E結構域，負責將L-Asn9、L-Trp10和L-Orn11異構化為相應的D-氨基酸。最后一個模塊包含一個MT結構域，用于將甲基轉移到WAP-8294A2的Val12的氨基氮上。最后，合成的十二肽鏈轉移到位于WAPS2末端的硫酯酶(thioesterase,TE)結構域上的保守Ser活性位點，利用脂肪酰基鏈的3-羥基作為親核試劑攻擊肽基-O-TE的羰基碳來催化分子內環化并釋放大環內酯。

2 活性靶點及其構效關系

2.1 WAP-8294A2的活性靶點

2018年，Itoh等[30]發現WAP-8294A2與抗生素溶血素lysocin E(3)(三十七元環)結構非常相似，其中有6種氨基酸L-Ser,Gly,N-Me-D-Phe,L-Leu,L-Glu 和D-Trp都是相同的(圖4)，這兩種化合物可能有相同的作用機制。lysocin E(3)的分子靶標是甲基萘醌(menaquinone,MK)，細菌細胞呼吸鏈中電子轉移的重要因素，也是金黃色葡萄球菌呼吸鏈中唯一的輔酶，它對細胞膜功能完整性的維持至關重要(圖5)[31-32]。

圖4 WAP-8294A2與lysocin E的結構(相同氨基酸用黑色加粗標出)[30]Fig.4 Structures of WAP-8294A2 and lysocin E (The same amino acids are in bold) [30]

圖5 lysocin E的活性靶點與作用機制[31-32]Fig.5 Proposed active target and mechanism of action for lysocin E[31-32]

接著,Itoh等[30]通過膜電位評估實驗，發現WAP-8294A2(1)和(2)都具有與lysocin E(3)相同的功能，影響細菌細胞膜的功能完整性；該課題組共使用了4種類型的脂質體來研究WAP-8294A2(1)和(2)的MK依賴性膜裂解，制備了包含蛋黃磷脂酰膽堿(PC)/蛋黃磷脂酰甘油(PG)(50:50,V/V)和PC/PG/心磷脂(CL)(50:40:10,V/V/V)的大單層囊泡(LUVs)以模擬細胞膜帶負電荷的表面，并與lysocin E(3)進行比較。實驗發現與陰離子脂質(PG和CL)相比，MK可以顯著增強WAP-8294A2(1)和(2)的活性，這表明WAP-8294A2(1)和(2)的有效膜裂解活性依賴于MK的存在。

同時，金黃色葡萄球菌中的menB和menA基因分別參與了MK生物合成途徑中萘醌(naphthoquinone)的形成和異戊二烯鏈(isoprenyl chain)與萘醌的連接，它們的缺失會導致金黃色葡萄球菌中MK的完全喪失。因此實驗還構建了MK缺失突變體ΔmenB和ΔmenA，與野生型(4 μg/mL)相比，WAP-8294A2(1)和(2)對突變體的活性可忽略不計(＞120 μg/mL)，說明其抑菌活性與MK的產生之間存在很強的相關性；WAP-8294A2(1)和(2)也是通過選擇性識別存在于革蘭陽性細菌細胞質膜中的MK，并通過破壞細胞膜來殺死細胞，從而達到致死性的抗菌效果。

2.2 構效關系

2020年，Chen等[33]結合之前的合成策略，利用D-Orn11-N-Me-L-Val12連接點作為環化點，通過D-Orn11的N端胺攻擊近端酯-羰基來避免形成二酮哌嗪。樹脂結合的線性肽使用Fmoc固相肽合成方案(SPPS)從2-氯-三苯甲基氯(2-CTC)樹脂開始合成，最后階段使用液相大環內酰胺環化策略進行快速組裝。最終獲得了約13%產率的WAP-8294A2及其類似物，即：WAP-8294A2(W1)、結構類似物W2、脫氧類似物W3和脫甲基類似物W4的全合成(圖6A)，其中W1、W2、W3對革蘭陽性菌菌株(包括Staphylococcus aureusATCC29213和MRSA臨床分離菌株SA86)的MIC值分別為1、1和2 μg/mL，與報道的WAP-8294A2(0.78 μg/mL)非常一致，這一結果表明D-OH-Asn2上的羥基對抗菌活性不是必需的。

Chen等[33]在合成過程中發現D-Asn2-WAP與WAP一樣活躍。因此，實驗對D-Asn2-WAP進行Ala掃描，這種方法通常用于評估氨基酸的每個側鏈基團對活性的影響。實驗依次用Ala替換每個殘基，同時保持其天然立體化學結構：L-Ala用于位置1、3、4、6和8，D-Ala用于2、5、7、9、10和11。成功合成Ala掃描類似物后，并對兩種類型的革蘭陽性細菌Staphylococcus aureusATCC29213和MRSA SA86進行了MIC測定。發現用Ala替換Ser1、D-Asn2、Ser3、Glu8和D-Asn9產生與W3相當的活性(MIC值0.5～2 μg/mL)，表明Ser1和Ser3的羥基、D-Asn2和D-Asn9的酰胺基團以及Glu8的羧酸基團對活性并不是必需的，這些位置可以容忍非極性氨基酸替換；但Gly4、N-Me-DPhe5、Leu6、D-Orn7、D-Trp10和D-Orn11被Ala取代，導致活性喪失，表明位置4、5、6、7、10和11對氨基酸取代高度敏感，僅允許化學性質或大小相似的氨基酸取代。

同時進行了Lys掃描補充實驗，制備了在1、3、6和8位含有L-Lys，以及在2、7、9和11位含有D-Lys的8個類似物。MIC結果發現只有用Lys替換Leu6才會導致活性完全喪失，結合之前的Ala掃描分析發現第1、2、3、8和9位氨基酸不僅可以耐受非極性氨基酸，還可以耐受帶正電荷的極性氨基酸殘基，而Leu6的非極性取代對于抗菌活性非常重要，7和11位可以耐受保留帶正電荷取代的修飾。在Ala掃描和Lys掃描研究的基礎上，該課題組還進一步研究了D-Orn7、D-Trp10和D-Orn11。D-Orn7和D-Orn11殘基分別被D-His或D-Arg取代，D-Trp10分別被D-Phe或D-Tyr取代。MIC結果發現用D-His或D-Arg替代D-Orn7和D-Orn11導致活性有所降低，而用D-Phe或D-Tyr修飾D-Trp10使得抗菌活性完全喪失。這些結果表明，第7位和第11位帶正電荷的取代和吲哚取代對抗菌活性都起著重要作用。

綜上所述，該課題組一共制備了11個Ala掃描類似物和8個Lys掃描類似物用于系統的構效關系(structure-activity relationship,SAR)研究，并通過體外革蘭陽性菌的抗菌活性實驗分析，初步建立了系統的構效關系，即：WAP-8294A2結構中的第1、2、3、8和9位氨基酸耐受修飾而不喪失抗菌活性，第7、11位氨基酸僅耐受化學性質或大小相似的修飾，而位置4、6和10上的氨基酸不允許改動(圖6B)，并且這3個位置對應的氨基酸剛好對應于lysocin E中相同的3種氨基酸，說明Gly4、Leu6和D-Trp10可能是活性靶點在革蘭陽性菌細胞膜MK上的這類化合物的保守氨基酸。這些研究為后續結合組合生物合成進一步開發潛在高活性WAP-8294A衍生物奠定了基礎。

圖6 WAP-8294A2及其全合成類似物結構與可修飾氨基酸[33]Fig.6 Structures and modifiable amino acids of WAP-8294A2 and its total synthesis analogues[33]

3 WAP-8294A類抗生素產量的提高

3.1 位點特異性整合表達載體構建

2013年，Wang等[34]發現了用于從大量野生型和非目標轉化子群體中快速、簡便地鑒定目標轉化子的一種簡便易行的篩選方法，該方法基于菌體生長過程中從明顯的黃色到黑色的顏色變化，作為關鍵基因位點特異性整合的視覺篩選標記。通過轉座子隨機誘變，實驗從黃色產酶溶桿菌中鑒定出黑色菌株，它是由于hmgA(Tyr/Phe代謝所需基因)的破壞而產生的，hmgA編碼尿黑酸1,2-雙加氧酶，該基因失活會阻斷氧化裂解反應的進行，導致尿黑酸的積累，從而使菌體呈黑色[35-36]。

ORF8編碼TonB依賴性受體，在WAPS中可能發揮一定的調控作用，能夠正向調節WAP-8294A類抗生素的產生[37-38]。此外，HSAF生物合成基因簇中也存在編碼TonB依賴受體的基因，而L.enzymogenesOH11基因組中也含有該基因簇并且也能產生抗真菌化合物HSAF。于是該課題組擴增了HSAF基因簇中5-非翻譯區的538 bp片段作為啟動子(PHSAF)，將其插入到破壞hmgA基因的載體中，同時對其SD序列進行增添、刪減等修飾，并對WAPS中的調節基因ORF8進行位點特異性整合，構建了表達載體，并導入到L.enzymogenesOH11中，證明了該方法的實用性。實驗分析發現與野生型菌株相比，黑色菌株的WAP-8294A和HSAF的產量分別增加了2倍和7倍。

3.2 前體底物

WAP-8294A類抗生素家族各成員差異主要包含脂肪酸鏈的長度和有無分支甲基。脂肪酸鏈在摻入到多肽之前，可能先通過ACL將其活化為相應的酰基CoA硫酯。2011年，Zhang等[19]發現在WAPS基因簇或其側翼區域中并不存在編碼ACL的基因。猜想活化的酰基-S-CoA或許可以直接作為底物摻入到多肽中或轉移到相應的酰基載體蛋白(ACP)上作為酰基-S-ACP。失活L.enzymogenesOH11基因組中未表征的編碼ACL的ORF(登錄號：JN596953)，發現抗菌活性部分喪失，并只產生了約50%產量的野生型WAP-8492A。結果表明，WAP-8492A生物合成途徑可能會從其他途徑利用trans方式募集ACL。

2015年，Chen等[39]從L.enzymogenesOH11基因組中搜索到7個推測的編碼酰基CoA連接酶的基因(ACL1-7)，并對每個基因都進行了單敲除，發現沒有一個突變體完全喪失了合成WAP-8294A 化合物的能力，多個ACL都有助于WAP-8294A的生物合成，其中ACL6似乎對WAP-8294A2的產量影響最大。通過體內敲除及體外合成3-羥基-7-甲基-辛酸-SNAC喂養實驗，ACL6缺失突變體中WA9-8294A2的產量得以恢復，表明ACL6是WAP-8294A2底物激活所必需的；相似的實驗也說明了ACL5可能是脂肪酰基摻入WAP-8294A1的重要貢獻者。

3.3 基因重構結合啟動子插入

基于WAP-8294A化合物的極強活性，低產量可能是L.enzymogenesOH11的一種自身保護機制。這些化合物對某些革蘭陽性菌具有強抑制活性，如金黃色葡萄球菌。而L.enzymogenesOH11本身屬于革蘭陰性菌，對WAP-8294A的處理并不敏感，很可能是因為革蘭陰性菌特有的低外膜(OM)滲透性為細胞提供了有效的滲透屏障，來抵抗包括抗生素在內的外部有害物質。而該菌卻是WAP-8294A化合物的生產者，其外膜不再是抗生素作用的屏障。所以，增強自身保護基因的表達，并結合關鍵生物合成基因的過表達，或許能提高WAP-8294A的產量。

CRISPR/Cas9系統是一種新型的基因組編輯工具，目前被廣泛使用[40-41]。2018年，Yu等[42]首次將CRISPR/dCas9系統應用于產酶溶桿菌中，通過將RNA聚合酶的ω亞基與靶向操縱子啟動子區域的dCas9融合來增加WAPS基因簇中5個共轉錄基因(ORF1-5)的表達，其中菌株dCas9-ω3中基因的轉錄水平增加了5～48倍；同時重構了4個假定的自我保護基因(ORF6、ORF7、ORF9和ORF10)，并在組成型啟動子PHSAF的控制下將其重組為操縱子。引入到菌株dCas9-ω3中，使得自身保護基因的轉錄水平增加了20～60倍。在工程化菌株中，3種主要產物WAP-8294A1、WAP-8294A2和WAP-8294A4的產量分別增加了6、4和9倍。

3.4 營養及環境條件

WAP-8294A的調控機制目前還不是很清楚，為了快速有效地優化培養條件，2019年Chen等[43]對工程化的L.enzymogenesOH11菌株的營養和環境條件進行了系統研究來優化WAP-8294A的生產，并開發了一種基于活性的簡單篩選方法，用于在各種培養條件下對L.enzymogenesOH11進行抗生素活性篩選。該方法使用枯草芽胞桿菌作為測試菌，通過萬古霉素濃度的連續稀釋來建立抑菌圈大小與萬古霉素濃度之間的關聯。通過這種關系，可利用萬古霉素等效半定量地表示WAP-8294A類抗生素在L.enzymogenesOH11發酵液中的抑菌活性。

這種簡單的方法還能夠快速檢測所需的營養物質的種類和濃度，包括碳源、氮源、其他營養成分，如大豆油和鹽。使用優化的培養條件(GBS培養基g/L：葡萄糖，20；牛肉膏，5；大豆油，16；氯化鈉，1；碳酸鈣，1；pH 8.5)，能夠將 WAP-8294A類抗生素產量在小規模培養中提高近10倍，在放大發酵中提高約15倍；基于液相色譜-質譜分析和峰面積的結果分析，3種化合物WAP-8294A1、WAP8294A2和WAP-8294A4的產量分別增加了8.2倍、4.9倍和6.7倍；此外，實驗還發現可以通過培養基優化來控制菌株中WAP-8294A2與WAP-8294A1的比例。

4 展望

WAP-8294A是一組環狀脂肽，被認為是第一類對MRSA具有強效抑制活性的新化學實體。進入臨床實驗已有十幾年，但一直未能成藥進入市場。原因之一可能是在產酶溶桿菌中產量比較低，無法對其進行工業化生產。近10年來，研究者們對產酶溶桿菌發酵產生WAP-8294A過程中的培養、發酵、篩選、分離純化等各個環節都進行了研究嘗試，以期提高產量，目前僅僅是提高了10倍，約4 mg/L，用于成藥遠遠不夠；由于產酶溶桿菌中至少有9個基因簇編碼PKS和NRPS，各個基因簇之間可能存在各種競爭關系，且該細菌很難進行遺傳操作修飾。如果將該基因簇進行直接克隆，并在大腸埃希菌中進行基因敲除、重構、啟動子插入、模塊替換等遺傳修飾，并在優化的底盤菌中進行異源表達，再結合上述提高產量策略進行化合物提取、分離、純化，有望進一步提高WAP-8294A產量；原因之二可能是該類化合物化學合成繁瑣且具有細胞毒性，它的分子靶標是MK，細菌呼吸鏈中電子轉移的關鍵因素，對MRSA的抑制活性也是致死性的，如果結合SAR實驗結果及組合生物合成等技術，對其多元環進行結構優化，有望提高該類化合物活性、降低毒性，使其更加安全高效，為臨床I/II期提供更多試驗樣品。