小兒尿道下裂患者包皮組織中COX-2、TIMP1表達及臨床意義*

彭潛龍 田 穩 李創業 聶有能 趙夭望

湖南省兒童醫院 泌尿外科（湖南 410000）

尿道下裂（Hypospadias）是由于前尿道發育異常，尿道開口達不到正常位置，是小兒泌尿生殖系統疾病最常見的畸形之一，常伴有陰莖短小、下彎，使患兒不能站立排尿，甚至影響患兒成年后性功能和生育能力，嚴重影響患兒的身心健康。尿道下裂唯一的治療方法是手術矯正，但伴有較高的并發癥發生率，近年來，尿道下裂發病率高達0.4%，且仍有上升的趨勢，抗雄激素物質或雌激素是導致尿道下裂的一個重要原因[1,2]。因此，尋找與小兒尿道下裂有關的生物標志物，對改善患兒生活質量具有重要意義。環氧化酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）是一種誘導酶，正常生理情況下處于不表達或低表達，但在一些病理情況下高表達，大量研究表明，在細胞受到炎癥因子、化學藥物、癌基因等刺激時COX-2被迅速合成，從而參與炎癥反應、組織損傷、腫瘤的發生等，此外有研究報道，孕激素可刺激COX-2高表達，隨后COX-2誘導合成過量雌激素，從而促進子宮內膜癌的發生[3,4]。但關于COX-2在尿道下裂患兒包皮組織中的表達情況研究較少。金屬蛋白酶組織抑制因子1（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP1）為基質 金 屬 蛋 白 酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的 天然抑制劑，MMPs在人體內廣泛分布，參與血管形成、胎膜破裂、胚泡植入、腫瘤浸潤轉移、炎癥反應、內分泌失調等病理生理過程。TIMP1能夠和MMPs特異性結合，阻斷MMPs激活過程，阻礙MMPs與底物結合，抑制MMPs發揮降解作用，從而使睪酮等分泌異常，使機體內分泌紊亂動態平衡遭到破壞，從而引發一系列病理生理變化[5,6]。但是關于TIMP1在尿道下裂患兒包皮組織中的表達方面的研究較少，本研究采用免疫組化法檢COX-2、TIMP1在小兒尿道下裂患者包皮組織中的表達情況，并探討其與小兒尿道下裂之間的關系。

資料與方法

一、研究對象

選取2020年6月至2021年6月在我院泌尿外科收治的小兒尿道下裂患者151例為尿道下裂組，年齡5～11歲，平均年齡（6.91±1.62）歲；另選取71例尿道外口正常者為正常對照組，年齡4～12歲，平均年齡（7.48±1.59）歲；根據陰莖伸直后尿道外口位置將尿道下裂組患兒分為輕型組48例（陰莖遠側型、冠狀溝型、陰莖頭型）、中型組50例（后2/3陰莖干型）、重型組53例（會陰型、陰囊型、陰莖陰囊型）。納入標準：①臨床上通過典型的臨床表現和泌尿系的B超檢查等確診為尿道下裂；②無手術矯正史；③無兩性畸形或者其他系統疾病。排除標準：①合并尿道下裂以外的生殖器畸形；②合并其他器官的畸形和內分泌的異常；③臨床資料不全。本研究經我院倫理委員會批準（批件號：HCHLL-2020-47），所有受試者及其監護人對本研究知情同意，并自愿簽署知情同意書。

二、主要試劑與儀器

兔抗人COX-2、TIMP1抗體、羊抗兔IgG均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，DAB顯色劑購自武漢博士德生物工程公司；顯微圖像采集系統購自Nikon生物顯微鏡&SPOT成像系統，石蠟切片機購自英國SHANDON公司，雙目光學顯微鏡購自日本OLYMPUS公司，分光光度儀購自美國GretagMacbeth公司。

三、標本采集

取小兒尿道下裂患者手術后留取的包皮組織，同時留取陰莖發育正常包皮環切手術者的包皮組織，分別標記后放于-80℃中保存，待測。

四、免疫組織化學法檢測組織中COX-2、TIMP1表達

取出標本并進行切片，處理后分別滴加兔抗人COX-2（1:400）、TIMP1（1：400）抗體作為一抗，4℃過夜，用PBS沖洗，滴加生物素標記羊抗兔IgG二抗（1:1000），用PBS清洗3次，之后滴加DAB顯色進行染色，嚴格按照說明書操作，5-10min后用顯微鏡觀察染色情況，COX-2、TIMP1表達均為包皮組織真皮層纖維細胞胞漿內和/或胞膜，以細胞胞漿/胞膜內出現棕黃色為陽性。

五、結果判定

使用光學顯微鏡觀察，分別對和正常對照組中每張切片隨機挑選并對COX-2、TIMP1陽性細胞數量進行統計。①根據陽性百分率＜6%為0分、7%～29%為1分、29%～49%為2分、49%以上為3分。②根據著色強度：0分為無著色、1分為淺黃色、2分為棕黃色、3分為棕褐色，③根據二者乘積得到總分：≤3分為陰性（-），3～5分為弱陽性（+）；6～8分為中度陽性（++）；9～10分為強陽性（+++），+～+++均為陽性表達。

六、統計學方法

采用SPSS 19.0對數據進行統計學描述，計數資料采用[n（%）]進行描述，三組間比較采用單因素方差分析，采用Spearman法分析小兒尿道下裂患者包皮組織中COX-2、TIMP1的相關性，Logistic回歸分析與尿道下裂發生的有關因素，以P＜0.05代表具有統計學意義。

結 果

一、COX-2、TIMP1在正常對照組和小兒尿道下裂患者的表達情況比較

正常對照組包皮組織COX-2表達陽性19例，陰性52例，尿道下裂患者包皮組織COX-2表達陽性121例，陰性30例，小兒尿道下裂患者中包皮組織COX-2的陽性表達率高于正常對照組（P＜0.05）；正常對照組包皮組織TIMP1表達陽性48例，陰性23例，尿道下裂患者包皮組織表達陽性38例，陰性113例。小兒尿道下裂患者中包皮組織TIMP1的陽性表達率低于正常對照組（P＜0.05），詳見表1，圖1。

表1 COX-2在正常對照組和小兒尿道下裂患者的表達情況比較

圖1 免疫組化圖

二、不同程度小兒尿道下裂患者包皮組織中COX-2、TIMP1的表達情況比較

小兒尿道下裂患者中包皮組織COX-2的陽性表達率：重型組＞中型組＞輕型組（P＜0.05），TIMP1的陽性表達率：輕型組＞中型組＞重型組（P＜0.05），詳見表2。

表2 COX-2在正常對照組和小兒尿道下裂患者的表達情況比較

三、小兒尿道下裂患者包皮組織COX-2、TIMP1的相關性

小兒尿道下裂患者包皮組織COX-2與TIMP1的表達有關（r=-0.514，P＜0.05），詳見表3。

表3 小兒尿道下裂患者包皮組織COX-2、TIMP1的相關性

四、二元Logistic回歸分析小兒尿道下裂影響因素

將是否發生小兒尿道下裂作為因變量，以雌二醇、睪酮、包皮組織COX-2、TIMP1陽性表達作為水平自變量，進行二元Logistic回歸分析，結果顯示雌二醇、睪酮、COX-2、TIMP1水平與小兒尿道下裂的發生有關（P＜0.05），詳見表4。

表4 尿道下裂的影響因素分析

討 論

尿道下裂是兒童較為常見的泌尿生殖道先天畸形，約占新生男嬰的0.3%-0.5%，僅次于先天性心臟病，且近年來仍然呈上升趨勢，尿道下裂的病因涉及遺傳因素、環境因素、激素調控、基因突變等，妊娠早期母體接觸農藥、輻射、吸煙（被動）等都可能會增加尿道下裂的發生率。尿道下裂的病因和發病機制比較復雜，目前僅有低于5%的患兒能找到確切的發病原因，但對于大多數的尿道下裂患兒的病因仍然不是很了解，因此，尋找與小兒尿道下裂有關的生物標志物，對改善患兒生活質量具有重要意義[7,8]。

COX-2是經過細胞因子等誘導下表達，與炎癥反應、腫瘤的發生發展有關，近年來研究發現，Cox-2在多種癌組織，如子宮內膜癌、結腸癌呈高表達[9,10]。Ellen[11]等詳細介紹了COX-2在生殖內分泌領域中的作用，在內膜異位癥患者腺上皮中COX-2的表達高于正常婦女，提示COX-2的表達與內膜異位的發生有關。梁金紅[12]研究結果表明，COX-2子宮內膜癌中呈高表達，提示COX-2在子宮內膜癌的病理生理過程中起重要作用。楊勇波[13]等研究結果表明，宮頸癌組織中COX-2呈高表達，且與化療敏感性密切相關，可用于宮頸癌病人新輔助化療治療前化療敏感性的預測。妊娠早期母體的雌激素干預可引發胎兒發生先天性尿道下裂，COX-2可能參與了雌激素的信號轉導通路，其與小兒尿道下裂的發生有關[7]，本研究結果表明，與對照組比較，小兒患者COX-2陽性表達率升高，且COX-2陽性表達率隨小兒尿道下裂患者病情的加重而升高，提示COX-2可能在尿道下裂的發生中發揮一定的作用，與尿道下裂的嚴重程度密切相關，推測COX-2表達可能誘導雌激素分泌，通過介導雌激素的信號轉導通路參與了小兒尿道下裂的發生發展過程；多因素Logistic回歸分析結果表明COX-2是小兒尿道下裂患者發生的危險因素，提示COX-2可能與尿道下裂的發生具有一定的關系。

TIMP-1是一種相對分子質量28000的糖蛋白，能夠與活化的間質膠質酶、間質溶解素、MMP-9以非共價鍵形成復合物，抑制酶原的活化[14]。周琦[15]等研究結果表明，子宮內膜異位癥組織中TIMP-1與侵襲程度呈負相關，TIMP-1隨著子宮內膜異位癥臨床分期的升髙而降低，提示人工誘導TIMP-1表達可能抑制內異癥的發生發展。滿冬梅[16]等研究結果表明，子宮內膜異位癥患者異位內膜中TIMP-1 mRNA的表達下調，基質金屬蛋白酶9（MMP-9）表達上調，TIMP-1降低了對MMP-9的抑制作用，從而使異位內膜細胞具有更強的侵襲能力以及異位種植能力，提示TIMP-1、MMP-9在子宮內膜異位癥的發生發展過程中起極其重要的作用。尿道下裂由于胎兒內分泌紊亂主要是雙氫睪酮和睪酮的分泌紊亂而發生疾病，TIMP-1的異常表達可能是一種繼發性改變從而致使小兒尿道異位形成尿道下裂[7]。本研究結果表明，與對照組比較，小兒尿道下裂患者TIMP1陽性表達率降低，且TIMP1陽性表達率隨小兒尿道下裂患者病情的加重而降低，提示TIMP1能反映小兒尿道下裂患者病情的嚴重程度，推測TIMP-1低表達可能減少了對MMP的激活，無法降解睪酮等激素，使機體睪酮等激素水平異常發生內分泌紊亂平衡失調，從而參與小兒尿道下裂的發生發展過程；經Pearson法分析小兒尿道下裂患者COX-2、TIMP1表達呈負相關，提示COX-2、TIMP1可能共同參與疾病發生發展，多因素Logistic回歸分析結果表明TIMP1是小兒尿道下裂患者發生的危險因素，提示TIMP1的異常表達可能在尿道下裂發展演變存在一定關系。

綜上所述，COX-2、TIMP1表達情況可能與尿道下裂的發生發展演變有關，有望成為尿道下裂潛在的研究靶點。