基于網絡藥理學與分子對接探討“仙茅-淫羊藿”藥對治療勃起功能障礙的分子機制*

張 鳳 張靜益 楊薆黎 陽 方 俞旭君,

1.成都中醫藥大學附屬醫院，代謝性疾病中醫藥調控四川省重點實驗室

2.成都中醫藥大學醫學與生命科學學院/附屬生殖婦幼醫院

勃起功能障礙（erectile dysfunction,ED）作為男科性功能障礙疾病中的常見病之一，不僅對患者的身心健康造成極大困擾，還嚴重影響患者夫妻關系和諧及社會穩定。ED在傳統醫學中歸屬于“陽痿”范疇，病機上認為與腎虛、肝郁、血瘀、痰濕等密切相關，故其治法也常因人而異。二仙湯組成包括仙茅、淫羊藿、當歸、巴戟天、黃柏、知母，具有溫腎陽、補腎精、瀉腎火等功效，可用于男科因精氣虛寒、命火衰微所致陽痿等病。前期報道二仙湯可幫助改善ED患者的陰莖勃起效應，提高性交滿足感，并能增益大鼠血清NO濃度提高[1，2]。方中仙茅、淫羊藿溫腎陽、補腎精、辛溫助命門共為主藥，為補腎壯陽常用藥對。因此本研究旨在通過網絡藥理學與分子對接技術探究仙茅-淫羊藿藥對治療ED的物質基礎與分子機制，從而進一步證實在中醫辨證、辨病論治中中藥配伍運用的科學性、有效性，以期能夠對ED后續的臨床研究與治療提供一定的理論基礎和新的研究方向。

資料與方法

一、仙茅-淫羊藿藥對化學成分篩選

通過中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP）檢索仙茅、淫羊藿化學組成成分，以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%，且類藥性（Drug-likeliss，DL）≥0.18為篩選條件篩選出藥對化學成分。

二、化學成分作用靶點預測與有效活性成分獲取

利用TCMSP和pubchem數據庫獲取各個化學成分的Canonical SMILES結構式，導入Swiss Target Prediction數據庫預測化學成分作用靶點，選擇物種為“Homo sapiens”，根據經驗選取probability值≥0.04的靶點為化學成分作用靶點。

三、勃起功能障礙疾病靶點獲取

以“勃起功能障礙（Erectile dysfunction）”為關鍵詞，分別在Genecards、OMIM、DrugBank數據庫中挖掘調治ED的潛在靶點。在Genecards數據庫中，若靶點過多可選擇Score值＞中位數的靶點為ED的治療靶點，靶點Score值越高代表其與ED的聯系越緊密。將上述3個疾病數據庫所獲靶點合并去重后得到ED治療靶點。

四、藥對-活性成分-疾病-靶點網絡圖構建

將仙茅-淫羊藿藥對作用靶點和ED治療靶點導入微生信平臺（http://www.bioinformatics.com.cn）構建成比例面積文氏圖，并獲得藥對-疾病共同靶點，此共同靶點即為仙茅-淫羊藿藥對治療ED的潛在靶點。將共同靶點與藥對化學成分進行映射后，得到藥對有效活性成分，然后利用Cytoscape3.7.2構建藥對-活性成分-疾病-靶點網絡圖。

五、PPI網絡構建與拓撲分析及關鍵靶點篩選

將篩選出的藥對-疾病共同靶點導入STRING數據庫中構建PPI網絡，選擇物種為“Homosapiens”，其余均采用默認設置。將所獲PPI網絡數據導入Cytoscape3.7.2進行可視化顯示，分析網絡后以BetweennessCentrality、ClosenessCentrality值均大于等于中位數，且AverageShortestPathLength小于等于中位數為基礎篩選條件，選取degree值大于2倍中位數的靶點作為仙茅-淫羊藿治療勃起功能障礙的關鍵靶點，并對關鍵靶點單獨進行可視化顯示。

六、GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

將仙茅-淫羊藿藥對治療ED的潛在靶點導入Metascape平臺，選擇物種為“H.sapiens”，分析方式為“Custom Analysis”，設置P＜0.05，進行基因的GO與KEGG通路富集分析。其中GO功能富集分析包括生物學過程 （Biological Processes，BP）、細胞組分（Cellular Components,CC）、分 子功能（Molecular Functions，MF）三部分。以P值為主要篩選條件，包含靶點數為次要篩選條件分別選取前20項作為關鍵條目導入微生信平臺構建柱狀圖和氣泡圖進行可視化顯示。

七、分子對接

將關鍵靶點的“degree”值由高到低排序，選取排名前3的靶點與作用靶點個數前6的關鍵活性成分進行分子對接。①靶點蛋白結構準備：AKT1（PDB ID:4GV1），TP53（PDB ID：5BUA），VEGFA（PDB ID：5DN2）靶點蛋白結構均來自RCSB數據庫（https://www.rcsb.org/）。蛋白結構在Maestro11.9平臺進行處理，用Schr?dinger Maestro的Protein Preparation Wizard去除蛋白結晶水，補加缺失的氫原子，并修復缺失鍵信息，修補缺失肽段，最后對蛋白進行能量最小化、以及幾何結構的優化[3,4]。②小分子結構準備：從PubChem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載關鍵活性成分MOL000006,MOL000098,MOL001792,MOL003044,MOL004380,MOL004391的3D結構，并利用Chem3D進行格式轉化以及能量最小化，之后將所有小分子的結構導入Schr?dinger Maestro軟件建立數據庫，進行加氫、結構優化、能量最小化，保存為分子對接的配體分子數據庫。③分子對接：采用Schr?dinger Maestro軟件中的Glide模塊進行。所有分子均按LigPrep模塊的默認設置制備。在Glide模塊中進行篩選時，導入準備好的受體，以在受體網格生成中指定合適的位置。選取蛋白的原配體以及預測活性位點作為10A盒子的質心。最后通過SP方法進行分子對接及篩選。④對接結果篩選與分析：分析活性成分和靶點蛋白的作用模式，如產生的氫鍵作用、π-π相互作用、疏水相互作用等，得到活性成分與蛋白殘基作用的情況。再參考活性成分的對接打分，推測擬篩的化合物是否具有與陽性化合物相似的活性作用。

結果與分析

一、仙茅-淫羊藿藥對的有效活性成分與作用靶點

在TCMSP數據庫中檢索獲得仙茅-淫羊藿藥對化學成分共30個，其中仙茅7個、淫羊藿23個（見表1）。將仙茅、淫羊藿的各個化學成分導入SwissTargetPrediction平臺預測靶點，得到仙茅作用靶點47個，淫羊藿作用靶點445個，兩藥靶點合并去重后共得到445個作用靶點。

表1 仙茅-淫羊藿化學成分

二、ED治療靶點

以“Erectile dysfunction”為關鍵詞在Genecards數據庫中檢索獲得ED治療靶點共1692個，Score值最大31.52，最小0.21，中位數為1.97，篩選后得到ED治療靶點846個。OMIM和DrugBank數據庫中分別檢索獲得84個和28個靶點，將上述3個數據庫所獲靶點合并去重后獲得ED治療靶點共947個。

三、藥對-活性成分-疾病-靶點網絡圖構建

將仙茅-淫羊藿藥對作用靶點與ED治療靶點導入微生信平臺，構建成比例面積文氏圖，獲得仙茅-淫羊藿藥對與ED共同靶點121個（見圖1）。將共同靶點與藥對化學成分進行映射后，得到藥對有效活性成分共計24個，其中仙茅4個，淫羊藿20個。將藥對有效活性成分、藥對疾病共同靶點、藥物名稱和疾病名稱導入Cytoscape 3.7.2構建藥對-活性成分-疾病-靶點網絡圖進行可視化顯示（見圖2）。

圖1 仙茅-淫羊藿藥對-勃起功能障礙靶點文氏圖

圖2 藥對-活性成分-ED-靶點網絡圖

四、PPI網絡構建與分析及關鍵靶點篩選

將仙茅-淫羊藿藥對治療ED的潛在靶點導入string數據庫構建PPI網絡及拓撲分析，PPI網絡圖中共計121個節點，1313條邊，平均節點度為21.7。將上述PPI網絡數據導入Cytoscape 3.7.2進行可視化顯示(見圖3)，并根據靶點連接度、中間中心性、親密中心性、平均最短路徑長度的大小篩選出絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（Protein kinase Bα，AKT1）、血管內皮生長因子A（Vascular endothelial growth factor-A，VEGFA）、腫瘤蛋白p53（Tumor protein p53，TP53）、表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）等21個仙茅-淫羊藿藥對治療ED的關鍵靶點。其中靶點連接度排名前三的AKT1、VEGFA、TP53，其連接度依次為73、72、69。靶點連接度越大，表示其越有可能為仙茅-淫羊藿藥對調治ED的關鍵靶點。

圖3 仙茅-淫羊藿藥對治療ED的潛在靶點及關鍵靶點的PPI網絡圖

五、GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

將仙茅-淫羊藿藥對治療ED的靶點導入metascape數據平臺進行GO與KEGG富集分析。分析結果顯示其潛在治療靶點主要參與以細胞對氮化合物的反應、血液循環、蛋白磷酸化的正向調節及跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路等為主的1947個生物學過程，和以受體復合物、膜筏、膜微域、神經元細胞體等為主的137個細胞組分，以及以蛋白激酶活性、磷酸轉移酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性為主的198項分子功能（見圖4）。主要通路涉及以EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、PI3K-Akt、cAMP、5-羥色胺能突觸、MAPK等為主的161條信號通路（見圖5，表2）。

圖4 仙茅-淫羊藿藥對治療ED潛在靶點的GO富集分析

圖5 仙茅-淫羊藿藥對治療ED潛在靶點的KEGG通路富集分析

表2 仙茅-淫羊藿藥對治療ED的主要KEGG通路中的富集靶點

六、分子對接結果與分析

根據SP方法得到分子對接結果[5]（見表3）。此外，靶點蛋白與小分子的復合物采用Pymol2.1進行可視化分析（見圖6）。

圖6 仙茅-淫羊藿關鍵活性成分DFV與AKT1、VEGFA、TP53分子對接模式

表3 活性成分的靶點蛋白對接結果

分子對接結果表明，仙茅-淫羊藿藥對的6個關鍵活性成分與3個靶點蛋白均存在很好的結合作用且匹配度高（結合能均小于-6 kcal/mol）。其中，MOL001792（DFV）與AKT1，TP53，VEGFA靶點在對接打分以及結合模式方面表現最好。將對接后活性成分與蛋白形成的復合物利用Pymol2.1軟件進行可視化（每個靶點選取打分最好的活性成分），得到活性成分與蛋白的結合模式，根據結合模式可以很清晰的看到活性成分與蛋白口袋相結合的氨基酸殘基。DFV與AKT1蛋白的活性位點存在相互作用的氨基酸殘基有VAL-164，ALA-177，MET-227，TYR-229，THR-211，ALA-230，MET-281，GLU-234，PHE-438，GLY-157等。DFV是黃酮類化合物，含有多個活性基團，能夠與活性位點氨基酸（GLU-234，ALA-230）形成很強氫鍵相互作用，氫鍵距離短，結合力強，對錨定蛋白空腔中的穩定殼聚糖分子有著重要作用。另外，該化合物的苯環能夠與VAL-164，VAL-177形成π-π共軛相互作用，對穩定蛋白口袋中的小分子有著重要貢獻。DFV化合物與TP53，VEGFA兩個靶點形成很強的氫鍵相互作用以及疏水相互作用，與蛋白口袋能夠形成很好的匹配作用，與蛋白有著很好的關聯性。同時也間接驗證了化合物對AKT1，TP53，VEGFA靶點具有調節作用。

討 論

ED屬于中醫“陽痿”范疇，中醫概括其癥狀特點為“痿而不舉，舉而不堅，堅而不久”，認為其病機以腎虛為本，肝郁氣滯、濕熱、血瘀等為標，單獨或多種因素共同作用釀生本病[6]。臨證常選用仙茅、淫羊藿、巴戟天、肉蓯蓉等補腎壯陽類中藥治療男子因命門火衰、腎氣虛寒所致的陽痿。其中仙茅、淫羊藿（又名仙靈脾）俗稱“二仙”，是臨床常用藥對，仙茅來源于石蒜科植物仙茅屬，味辛，性熱，有毒，以其葉似茅，根狀莖久服補腎陽、益精血、強筋骨而得名。《本草備要》載仙茅有“助命火、益陽道”之功。淫羊藿來源于小檗科植物淫羊藿屬全草，味辛、甘，性溫，主入肝腎，具有補腎壯陽、益精氣、強筋骨等多種功效。《日華子本草》言其有療“丈夫絕陽不起，女子絕陰”之效。兩藥合用，共奏益精填髓、壯陽起痿之功。現代藥理學亦表明仙茅、淫羊藿能直接作用于下丘腦-垂體-性腺軸及腎上腺皮質軸，增益細胞激素和生殖器官，且能發揮調節免疫、抗氧化、降糖、降脂、降壓等多種藥理作用[7,8]。

現代醫學認為陰莖海綿體平滑肌（penis cavernosum smooth muscle，PCSM）舒張和收縮信號通路異常是誘發ED的核心機制，血管內皮功能障礙與海綿狀血管生成受損[9]等均可致不同程度的ED。Baba[10]等人觀察到去勢術后大鼠陰莖中含有一氧化氮合酶（NOS）的神經纖維數顯著低于接受假手術的大鼠組，且伴有勃起功能明顯下降。而去勢術后接受延遲睪酮替代治療的大鼠陰莖中含有NOS的神經纖維數和勃起功能與假手術組大鼠無顯著差異。這表明睪酮水平可能在男性勃起功能的啟動和維持中起著重要作用，但目前睪酮對陰莖組織的影響仍存在爭議。本研究結果表明，仙茅-淫羊藿藥對治療ED主要通過化合物DFV、金圣草（黃）素、木犀草素、槲皮素等來發揮作用。金圣草黃素、木犀草素和槲皮素為天然黃酮類化合物，三者均具有較好的抗炎、抗氧化作用。同時，現有研究亦證實槲皮素具有較好的擴血管和保護血管內皮功能等藥理作用[11]，其可能通過減少海綿體組織的內皮細胞凋亡、增強內皮型一氧化氮合酶（eNOS）表達及NOS的活性來改善動脈性ED大鼠的勃起功能[12]。Adefegha SA[13]等人發現槲皮素能顯著降低帕羅西汀誘導的ED大鼠陰莖組織中AChE、PDE-5、精氨酸酶、ACE等與勃起相關酶的活性，并改善抗氧化狀態。木犀草素亦能通過減少氧化應激、提高NO含量和NOS活性來降低高糖介導的內皮依賴性舒張反應損傷[14]。金圣草（黃）素對勃起功能的調節作用尚不明確，但已有研究報道其可能通過阻斷激活蛋白1活化有效抑制脂多糖誘導的誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的基因表達，使NO的釋放減少[15]。DFV由于目前缺乏文獻支持，其藥理作用及機制仍需后續實驗進一步證實。

根據本研究結果顯示，仙茅-淫羊藿藥對治療ED的靶點主要為AKTI，VEGF，TP53等，且其治療ED的潛在靶點主要富集在EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性通路、PI3K-Akt通路、cAMP通路、MAPK通路等。現有研究表明，NO由NOS催化L-精氨酸產生。AKT1作為PI3K-Akt信號通路的主要參與者，可調節NOS的表達與活性，進而影響陰莖勃起的關鍵因子-NO的生成。NO主要通過一氧化氮/環磷酸鳥苷（NO/cGMP）通路引起PCSM舒張，改善陰莖海綿體內皮功能，從而增強勃起功能[16,17,18]。具有類似調控作用的還有cAMP通路。與之相反，蛋白激酶類則通過參與蛋白激酶C/蛋白激酶C磷酸抑制蛋白17（PKC/CPI-17）或細胞外調節蛋白激酶1/2（ERK1/2）通路調節PCSM的收縮功能，導致ED的發生[9]。ERK屬于MAPK家族，MAPK信號通路在細胞的增殖、分化和凋亡中起關鍵作用，其家族成員還包括應激激活蛋白激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）。通過抑制ERK、JNK、p38信號通路可降低精氨酸酶活性，增強內皮和氮能神經介導的糖尿病小鼠海綿體舒張功能，從而改善勃起功能[19]。此外，血管內皮生長因子(VEGF)也可通過促進血管增生、改善血流灌注、上調NOS表達改善陰莖勃起功能[20]。已有研究證實VEGF在海綿體平滑肌細胞中的表達水平可隨著年齡的增長而逐漸下降[21]，提示ED隨著年齡增長發病率逐漸上升的特點或與此有關。郭玉剛[22]等人經動物實驗表明高脂血癥大鼠陰莖組織中的VEGF含量的明顯降低可能是高脂血癥繼發ED的發病機制之一。楊文德[23]等人通過對雙側海綿體神經損傷的大鼠移植VEGF和GDNF共過表達的脂肪源性干細胞，發現其可促進陰莖海綿體神經的修復、保護血管內皮、預防纖維化，恢復神經源性ED大鼠的勃起功能。TP53是一種廣譜腫瘤抑制基因，可抑制細胞的生長、增殖與分化，已有研究報道TP53表達降低可抑制海綿體內皮細胞凋亡，改善勃起功能[24]。但目前針對TP53在男性生殖系統中所起作用的相關研究較少，其在ED的發生發展過程中所起作用及機制仍有待進一步研究證實。

綜上所述，預測仙茅-淫羊藿藥對治療ED具有多成分、多靶點、多通路的特點，二者在治療靶點上既有相同點，又有不同點，可起到相互促進、相互補充、相輔相成的作用。通過本研究為今后進一步深入研究仙茅-淫羊藿藥對治療ED的作用機制奠定了一定的理論基礎，同時也為研發治療ED的新藥提供了新的思路。本研究不足之處在于研究結果均基于生物信息學分析所得，所獲理論結果仍需后續輔以動物實驗或臨床試驗加以證實。