北京黑豬NR6A1、VSX2、VRTN、LTBP2基因多態性與脊椎數及胴體性狀的關聯分析

牛乃琪，劉 倩，侯欣華，劉 欣，王立剛，趙福平，高紅梅，石麗君，王立賢，張龍超

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193)

在脊椎動物進化中，豬是為數不多存在脊椎數變異的動物之一。北京黑豬是20世紀60年代由巴克夏、大白以及中國地方豬種雜交形成的一個地方豬種，其脊椎數(胸椎和腰椎的總和)存在從20～23節 的表型變異。脊椎數是高遺傳力(0.6～0.62)的經濟性狀，它的增加對于動物的體尺、胴體長、胴體重和生產性能有顯著的正向影響。在豬中胸腰椎數的變異極大，頸椎和薦椎數基本固定，頸椎數一直固定在7節，薦椎數固定在4節，尾椎數雖有較大差異但與胴體長無關。研究表明，每增加一根脊椎胴體長將增加80 mm。Wada等將影響豬脊椎數的QTL定位在1號染色體上(SSC1)；隨后，Sato等構建了梅山母豬×杜洛克公豬的F2資源群體，將影響胸腰椎總數的QTL定位于SSC1和SSC7上。通過進一步的深入研究，在SSC1上發現了核受體亞家族6A組成員1(6A1)，在SSC7上發現了椎骨發育相關基因()和潛在轉化生長因子β結合蛋白2(2)。

6A1是一個在胚胎發育中發揮重要作用的基因，在早期小鼠胚胎和后期發育中的神經系統廣泛表達。在體節發生過程中，突變的胚胎會形成13體節而代替原來的25體節。6A1是一個利用多種輔抑制因子復合物來抑制和沉默基因轉錄的轉錄抑制因子，錯義變異發生在鉸鏈結構域，這是6A1與核受體輔阻遏子1 (NCoR1)和核受體相關蛋白80 (RAP80)相互作用的必要條件。

2亦稱10，是基因家族中獨一無二的一簇，它們在脊椎動物軸向骨骼進化中發揮著核心作用。被認為是影響脊椎數強有力的候選基因。隨后試驗證明，是一種新型的位于細胞核中的DNA結合轉錄因子，在全基因組范圍內與DNA結合，并調節一組含有結合基序的基因轉錄。2是包含LTBPs 1-4和fibrillins 1、2和3的LTBP-fibrillin的基因家族中的一部分，LTBP家族是一組細胞外多結構域蛋白，具有多種獨特的生物學特性。所有的4種 LTBP異構體都與fibrillin微纖維相關，LTBP-1、2和4的C端都與fibrillin-1 N端相似的區域相互作用。2是家族唯一一個不與TGFβ結合而可以獨立存儲和激活的成員。

雖然上述4個基因已被認為是影響脊椎數及胴體性狀的候選基因，但在北京黑豬中的多態性及與性狀的關聯分析尚未見報道。本研究旨在對4個基因的所有外顯子區進行聚合酶鏈式反應(PCR)、突變位點檢測及開展基因型與脊椎數及胴體性狀的關聯分析，以期探索調控性狀變異的候選基因功能位點，為下一步闡釋性狀變異的遺傳機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 組織樣品的采集及表型數據的測定和記錄

收集(210±7)日齡的410頭北京黑豬組織樣并記錄脊椎數和胴體性狀。動物均飼養在北京黑六牧業科技有限公司。

1.2 DNA提取

使用DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit)進行組織樣品的DNA提取，使用超微量分光光度計(IMPLEN)進行DNA濃度、核酸與蛋白及酚類物質最高吸收峰的吸收波長比值(260 nm/280 nm)、核酸與碳水化合物最高吸收峰的吸收波長比值(260 nm/230 nm)的檢測，并用2%的瓊脂糖凝膠進行DNA質量檢測評估，將質量合格的DNA樣品放入-20 ℃的冰箱中存放。

1.3 引物設計及合成

利用Primer Premier 5.0對6A1(NM_001097499.1)、2(XM_021100021.1)、(NM_001195113.1)及2(XM_021099520.1)基因共設計53對引物，由于引物較多，本研究將找出突變位點的引物列于表1，設計好的引物均有北京六合華大基因科技有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 聚合酶鏈式反應(PCR)

采用25 μL的反應體系(Code：P505-d1，Vazyme)：2×Phanta Max Buffer 12.5 μL，0.5 μL 聚合酶，0.5 μL dNTP，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，8.5 μL 無菌水，1 μL 模板。PCR程序如下(ABI，Singapore)：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s， 57～62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30～90 s，35個循環；72 ℃延伸2 min。對410頭北京黑豬使用96孔板采用以上程序進行PCR擴增，PCR產物通過1.5%凝膠進行切膠回收單一條帶，在北京六合華大基因科技有限公司平臺進行雙向的Sanger測序。

1.5 數據統計分析

對PCR擴增得到的產物測序后使用DNAStar中的SeqMan進行基因分型，使用Microsoft Excel 2016進行基因型頻率和等位基因頻率的統計。使用SAS 9.2進行表型與基因型的關聯分析，采用Duncan′s多重檢驗評估不同基因型之間差異的顯著性(<0.05)，數據使用“平均值±標準差”表示，<0.05判定為差異顯著。

2 結 果

2.1 北京黑豬表型數據的描述

410頭北京黑豬個體的表型值(脊椎數和胴體性狀)，脊椎數的均值達21節，變異系數為2.76%；胴體長的均值達97.99 cm，變異系數為4.84%；胴體直長的均值達89.88 cm，變異系數為4.53%；胴體斜長的均值達76.12 cm，變異系數為4.35%；胴體重的均值達64.32 kg，變異系數為11.72%(表2)。

表2 脊椎數和胴體性狀的表型值統計

2.2 NR6A1、VSX2、VRTN和LTBP2基因突變位點的基因型頻率及等位基因頻率

通過對4個基因進行PCR擴增后共發現15個突變(表3和表4)分別在CDS和3′UTR區，其中1個 為2基因的同義突變，5個為基因的3′UTR突變和9個為2基因的3′UTR突變。這15個SNPs的基因型頻率變化范圍為4%～78%，其等位基因頻率變化范圍15%～85%。

表3 北京黑豬中VSX2和VRTN突變位點的基因型頻率及等位基因頻率統計

表4 北京黑豬中LTBP2突變位點的基因型頻率及等位基因頻率統計

2.3 NR6A1、VSX2、VRTN和LTBP2的15個SNPs的數據統計分析

6A1、2、和2基因通過PCR擴增篩選得到的15個SNPs位點(2上1個同義突變；上5個3′UTR；2上9個3′UTR)的基因型與北京黑豬的脊椎數、胴體長、胴體直長、胴體斜長及胴體重的關聯分析結果見表5和6。2上1個同義突變c.536 G>A與脊椎數顯著相關，與與胴體長、胴體直長、胴體斜長及胴體重無顯著相關；上c.2598 A>G、c.2607 G>T與脊椎數、胴體長、胴體直長和胴體斜長關聯顯著，與胴體重關聯不顯著，c.2715 C>T與脊椎數、胴體長、胴體直長、胴體斜長和胴體重關聯不顯著，c.3087 G>C只與胴體斜長關聯顯著，與脊椎數、胴體長、胴體直長和胴體重關聯不顯著，c.3094 A>G與脊椎數和胴體斜長關聯顯著，與胴體長，胴體直長和胴體重關聯不顯著；2上6個(c.7158 A>G、c.6869 C>T、c.6319 G>C、c.6246 G>T、c.6170 A>G、c.6079 G>T)與脊椎數差異顯著相關，但與胴體長、胴體直長、胴體斜長及胴體重關聯均不顯著。

表5 VSX2和VRTN基因6個SNPs與脊椎數和胴體性狀的關聯分析

3 討 論

豬的脊椎數是一個重要的影響豬體型性狀的高遺傳力經濟性狀。對豬的脊椎數經過長期的研究，將QTL定位在了SSC1和SSC7上。研究表明，通過全基因組關聯分析得到，SSC1上的6A1被認為是影響脊椎數和體長性狀的候選基因，并發現6A1(c.748C>T)發生堿基替換，導致了192密碼子脯氨酸突變為亮氨酸。等位基因T在所研究的西方商業種豬中(杜洛克，大白和長白豬)似乎都是固定的，而在中國本地豬種和野豬中表現出更高的CC基因型頻率。不僅如此，6A1基因的多態性對豬的體尺的增減及家豬和野豬的區分有重要影響。已有研究表明，6A1基因的滲入對于河南本土豬的體型大小和飼料轉化率有顯著影響。本研究通過對6A1基因的全部外顯子區在北京黑豬群體中進行PCR擴增，發現均是固定的TT基因型，也未發現其他與脊椎數和胴體性狀顯著相關的突變。

在SSC7上，2(也稱10)由于可以阻止肋骨的形成，因此對脊椎動物脊柱腰椎區的形成至關重要?；谒闹匾裕瑢ζ溥M行PCR擴增，發現了一個同義突變(c.536 G>A)，這一突變對脊椎數有著顯著影響?；蛭挥赟SC7上，是影響豬多個性狀的候選基因，如脊椎數變異、繁殖性狀等，且在脊椎形成過程中是一個關鍵的轉錄因子。先前報道了變體與中國和西方豬種的胸椎數(肋骨數)顯著相關，在研究中將作為獲得豬高脊椎數和長度相關性狀的有效選擇標記，是影響幾個西方豬種肉品質可能的基因標記?；谝陨涎芯?，Yang等利用中國地方豬種二花臉以及白杜洛克與二花臉構建的F2群體和兩個西方品種證明了突變的因果突變很可能是從中國豬種滲入歐洲豬種的。本研究在基因中發現5個 3′UTR突變，3個(c.2598 A>G、c.2607 G>T、c.3094 A>G)與脊椎數顯著相關的SNPs；2個(c.2598 A>G、c.2607 G>T)與胴體長及胴體直長顯著相關的SNPs；4個(c.2598 A>G、c.2607 G>T、c.3087 G>C、c.3094 A>G)與胴體斜長顯著相關的SNPs。

表6 LTBP2基因9個SNPs與脊椎數和胴體性狀的關聯分析

隨著研究的不斷深入，在大白與民豬構建的F2資源群體中通過GWAS及單倍型的分析將SSC7上的區間縮小至951 kb，并將影響豬脊椎數的主效候選基因定位在此區間的2上。之后對長白豬與韓國本地豬的F2代群體進行了GWAS及單倍型的連鎖與連鎖不平衡分析，將關鍵區域定位在包括2在內的533.9 kb區域，更加驗證了2基因可作為影響豬脊椎數的候選基因。本研究在北京黑豬中共發現了9個3′UTR突變，其中c.7158 A>G、c.6869 C>T、c.6319 G>C、c.6246 G>T、c.6170 A>G、c.6079 G>T與脊椎數差異顯著相關，但是與胴體性狀關聯不顯著。

4 結 論

本研究通過使用410頭北京黑豬對6A1、2、和2等4個基因進行多態性探索及與脊椎數和胴體性狀的關聯分析，共發現15個 SNPs，其中2、和2上10個SNPs與脊椎數顯著相關；僅上4個SNPs與胴體性狀顯著相關，為探索調控性狀變異的候選基因功能位點和闡釋性狀變異的遺傳機理奠定基礎。