硫酸化黨參多糖對(duì)H2O2致RAW264.7細(xì)胞損傷和小鼠急性酒精損傷的保護(hù)作用

孫嘉琪，楊詩(shī)靖，譚 盈，白 霖，郭世寧,2，石達(dá)友,2*，劉 翠*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642； 2.廣東省獸用中藥與天然藥物工程技術(shù)研究中心，廣州 510642)

酗酒是一個(gè)重要的全球健康問(wèn)題，酒精攝入過(guò)多會(huì)引起機(jī)體肝損傷、免疫功能及脂質(zhì)代謝紊亂，其中免疫功能失調(diào)在急性酒精損傷的發(fā)展中扮演著重要角色。研究表明，酒精誘導(dǎo)的急性損傷模型中，小鼠體內(nèi)炎性細(xì)胞因子、趨化因子增加，激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)。在中醫(yī)理論中，酒性濕熱，過(guò)量飲酒之后，濕熱毒邪蘊(yùn)結(jié)體內(nèi)，損傷及脾，致脾之運(yùn)化功能失司，機(jī)體免疫力下降。黨參(())作為我國(guó)傳統(tǒng)藥物，具有健脾益氣、養(yǎng)血生津之功效，常用于脾肺氣虛、食少倦怠、咳嗽虛喘等方面的治療。現(xiàn)代研究表明，黨參含有多種天然藥理活性成分，如多糖、皂苷、生物堿、黃酮類等，其中黨參多糖(polysaccharide,CP)具有包括免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤等廣泛的藥理作用。研究表明，CP可改善由環(huán)磷酰胺所致免疫抑制大鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)，提高血清免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4水平，增強(qiáng)大鼠的免疫功能。近年來(lái)，利用硫酸化修飾獲得的硫酸化多糖具有較好的免疫調(diào)節(jié)作用。本研究旨在探究硫酸化黨參多糖(sulphatedpolysaccharide,SCP)對(duì)小鼠急性酒精損傷的保護(hù)作用，篩選出對(duì)急性損傷具有良好保護(hù)作用的中草藥活性成分，為研制新型中獸藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

RAW 264.7細(xì)胞，來(lái)源于ATCC細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

四周齡雄性昆明小鼠，體重20～25 g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖有限公司，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)：SYXK(粵)2014-0136，合格證號(hào)：37009200008032。試驗(yàn)期間飼喂小鼠全價(jià)飼料，自由飲水及采食，室溫控制在19～25 ℃，相對(duì)濕度為30%～70%。

1.3 主要儀器與試劑

BDS系列倒置生物顯微鏡購(gòu)自重慶奧特光學(xué)儀器責(zé)任有限責(zé)任公司；Thermo 3111CO培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific；MK3型酶標(biāo)儀購(gòu)自賽默飛(上海)儀器有限公司；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、青鏈霉素雙抗購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技責(zé)任有限公司；噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司；30% HO試劑購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20160401-1；ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：201709。

1.4 制備CP與SCP

用水煎醇沉法從黨參飲片中提取總多糖，選用sevage法去除蛋白，以DEAE-52纖維柱分離純化，制備CP。采用氯磺酸-吡啶法，以氯磺酸-吡啶(1∶6)制備酯化試劑，將CP在80 ℃下震蕩反應(yīng)3 h，乙醇沉淀后制備SCP。SCP的制備方法參照文獻(xiàn)[11]；采用苯酚-硫酸法，測(cè)定CP糖含量為81.20%，SCP糖含量為66.30%。

1.5 體外試驗(yàn)

1.5.1 RAW 264.7細(xì)胞急性損傷模型建立 以10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)RAW 264.7細(xì)胞，待其生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于試驗(yàn)。將細(xì)胞濃度調(diào)整至5×10個(gè)·mL加入96孔板，每孔100 μL，37 ℃、5% CO培養(yǎng)17 h后，在每孔分別加入不同濃度的HO，從濃度為200 mmol·L倍比稀釋11個(gè)濃度，分別于0.5、1 h后，用PBS漂洗2次，DMEM培養(yǎng)液換液，加入MTT 30 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入DMSO 100 μL，搖勻，酶聯(lián)免疫儀檢測(cè)570 nm處吸光值(A值)，計(jì)算RAW 264.7細(xì)胞經(jīng)HO氧化損傷刺激的抑制率：細(xì)胞抑制率(%)=(空白組OD組-HO組OD值/空白組OD值)×100。

1.5.2 SCP對(duì)HO誘導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)的影響 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW 264.7細(xì)胞濃度調(diào)至5×10個(gè)·mL，加入96孔板中，每孔100 μL，37 ℃、5% CO培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的CP與SCP，加入的CP和SCP濃度根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果篩選得出，CP濃度為2、2、2mg·mL，SCP濃度為2、2及2mg·mL。另設(shè)空白對(duì)照組(加含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液)及陽(yáng)性對(duì)照組(10 μg·mL)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入終濃度為12.5 mmol·L的HO培養(yǎng)1 h，建立HO氧化損傷；應(yīng)用倒置顯微鏡觀察HO刺激下各組RAW 264.7細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.5.3 SCP對(duì)HO誘導(dǎo)細(xì)胞的吞噬功能的影響 如“1.5.2”所述建立HO氧化損傷后，收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，各組分別加入FITC-葡聚糖，37 ℃避光孵育30、60、90 min，另設(shè)4 ℃對(duì)照組；孵育后各組加入PBS，2 000 r·min離心10 min，棄去上清，重復(fù)洗滌2次，除去未吸附的FITC-葡聚糖；PBS重懸細(xì)胞，配成1×10個(gè)·mL懸浮液，以未加FITC-葡聚糖的RAW 264.7作為陰性對(duì)照，流式細(xì)胞儀檢測(cè)染色細(xì)胞熒光。

1.5.4 SCP對(duì)HO誘導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放的影響 如“1.5.2”所述建立HO氧化損傷后，收集各組細(xì)胞上清液，采用ELISA法分別測(cè)定上清液白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)、干擾素-γ(IFN-γ)的含量。

1.6 體內(nèi)試驗(yàn)

1.6.1 試驗(yàn)分組與處理 90只雄性昆明小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨機(jī)分成9組，分別為空白對(duì)照組(B)，模型對(duì)照組(MO)，VC對(duì)照組(VC)，CP低、中、高劑量組(CPL、CPM、CPH)，SCP低、中、高劑量組(SCPL、SCPM、SCPH)。CP與SCP的3個(gè)劑量組分別按100、200、300 mg·kg小鼠體重每天進(jìn)行灌胃維生素C，VC組按100 mg·kg小鼠體重每天進(jìn)行灌胃，B和MO組給予同體積雙蒸水，連續(xù)灌胃30 d，末次灌胃后，禁食16 h，除B組外其余組小鼠灌胃50%乙醇12 mL·kg建立小鼠急性酒精損傷模型。

1.6.2 生長(zhǎng)情況 試驗(yàn)期間觀察各組小鼠生長(zhǎng)情況。分別于給藥前(D)和給藥后第7(D)、14(D)、21(D)及30(D)天稱量各組小鼠體重，計(jì)算平均體重，并計(jì)算平均日增重(ADG)=(終末體重-初始體重)/天數(shù)。

1.6.3 血液生理學(xué)檢測(cè) 灌服乙醇6 h后，每組隨機(jī)抽取5只小鼠，摘眼球采抗凝血，用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)定血液中白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血小板(PLT)、血紅蛋白(HGB)、淋巴細(xì)胞(LYM)和紅細(xì)胞比容(HCT)的含量變化。

1.6.4 血清生化學(xué)檢測(cè) 灌服乙醇6 h后，每組隨機(jī)抽取5只小鼠，摘眼球采血，析出血清，用全自動(dòng)血生化分析儀測(cè)定血清中甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、乳酸脫氫酶(LDH)的含量變化。

1.6.5 血清免疫因子測(cè)定 灌服乙醇6 h后，每組隨機(jī)抽取5只小鼠，摘眼球采血，分離血清，用ELISA法測(cè)定IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的含量。

1.6.6 臟器指數(shù) 造模6 h后，分別對(duì)每組小鼠稱量體重，剖檢，取心、肝、脾、肺、腎，稱重，計(jì)算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器重量(mg)/體重(g)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件單因素ANOVA分析各組間的差異顯著性，通過(guò)Duncan’s新復(fù)極差檢驗(yàn)法進(jìn)行各組間的多重比較，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。采用GraphPad Prism 5軟件制作柱狀圖。

2 結(jié) 果

2.1 RAW 264.7細(xì)胞急性損傷模型建立

不同濃度、不同作用時(shí)間下HO刺激RAW 264.7細(xì)胞的抑制率如圖1所示，200 mmol·L的HO對(duì)RAW 264.7的抑制率均最高，隨著HO濃度的降低對(duì)RAW 264.7細(xì)胞的抑制作用呈下降趨勢(shì)，25～200 mmol·L的HO作用0.5 h下對(duì)RAW 264.7細(xì)胞的抑制率>50%；12.5～200 mmol·LHO作用1 h對(duì)RAW 264.7細(xì)胞的抑制率>50%，且12.5與25、50 mmol·LHO作用1 h的抑制率無(wú)顯著差異(>0.05)。因此，選擇12.5 mmol·LHO作用1 h建立RAW 264.7細(xì)胞急性損傷模型。

A. H2O2刺激0.5 h；B. H2O2刺激1 h。柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)A. H2O2 stimulate 0.5 h; B. H2O2 stimulate 1 h. Different letters on the colum indicate significant difference (P<0.05)圖1 不同濃度H2O2對(duì)RAW 264.7細(xì)胞的抑制率Fig.1 Inhibition rate of different concentrations of H2O2 on RAW 264.7 cells

2.2 SCP對(duì)H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)的影響

各組RAW 264.7細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)如表1所示，B組 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，貼壁性好，個(gè)別細(xì)胞有輕微分化，細(xì)胞密度大，局部細(xì)胞發(fā)生復(fù)層；MO組細(xì)胞貼壁不良，大部分細(xì)胞發(fā)生完全分化，細(xì)胞較為稀疏，密度較B組低，培養(yǎng)液中略微存在細(xì)胞碎片。除CPL組細(xì)胞密度較低外，其余各給藥組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，密度較大，局部細(xì)胞出現(xiàn)復(fù)層，與B組相似。其中SCP各組的細(xì)胞密度、生長(zhǎng)狀態(tài)較佳，與B組及VC組相似。

2.3 SCP對(duì)H2O2刺激下RAW 264.7細(xì)胞的吞噬功能影響

由表2可知，4 ℃條件下，除SCPL組外，各組細(xì)胞的吞噬率均最低；37 ℃條件下，隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)，各組細(xì)胞的吞噬率呈上升趨勢(shì)。不同溫度與作用時(shí)間下MO組的細(xì)胞吞噬率均最低，37 ℃時(shí)顯著低于B組。4 ℃條件下，SCPL、SCPM、CPL組顯著高于MO組(<0.05)，且SCPL、SCPM、CPL組吞噬率與VC組差異不顯著(>0.05)；37 ℃下作用30 min，除SCPL組外，其余各組吞噬率均顯著高于MO組(<0.05)，其中SCPH、CPM組與VC組差異不顯著(>0.05)；作用60 min，SCPL、CPL組與VC組差異不顯著(>0.05)，SCPM組顯著高于VC組(<0.05)；作用90 min，除CPM組外，各組吞噬率均顯著高于MO組(<0.05)，其中SCPL、SCPM組與VC組差異不顯著(>0.05)。SCP對(duì)HO刺激下RAW 264.7細(xì)胞的吞噬作用優(yōu)于CP，尤其是SCPL、SCPM組。

表1 各組對(duì)H2O2刺激下RAW 264.7細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響

表2 各組對(duì)H2O2刺激下RAW 264.7細(xì)胞的吞噬率影響

2.4 SCP對(duì)H2O2刺激下RAW 264.7細(xì)胞的細(xì)胞因子水平影響

由表3可知，各組IL-2水平，與B組相比，MO組顯著降低(<0.05)，各SCP與CP組的IL-2水平均升高，與B組無(wú)顯著差異(>0.05)；IL-4水平，與B組相比，MO組IL-4水平顯著升高(<0.05)，SCPL、SCPM、SCPH及CPH組IL-4水平顯著低于VC組(<0.05)；IL-10水平，與B組相比，MO組IL-10水平降低，VC、CPL、SCPH和SCPL組IL-10水平高于MO組，且SCPH組IL-10水平高于VC組，但各組之間差異不顯著(>0.05)；IFN-γ水平，與B組相比，MO組IFN-γ水平顯著降低(<0.05)，各SCP與CP組的IFN-γ含量顯著高于MO組(<0.05)，其中SCPL、CPL組與B組、VC組差異不顯著(>0.05)。SCP各組對(duì)IL-4分泌的抑制作用以及對(duì)IFN-γ、IL-10分泌的促進(jìn)作用優(yōu)于CP各組，對(duì)IL-2分泌的促進(jìn)作用與CP各組無(wú)顯著差異，因此SCP對(duì)急性損傷細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用效果優(yōu)于CP。

表3 各組對(duì)RAW 264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平影響(n=5)

2.5 SCP對(duì)小鼠生長(zhǎng)情況的影響

觀察各組小鼠30 d內(nèi)的生長(zhǎng)情況，各組小鼠均精神正常、飲食正常，被毛順滑，無(wú)脫毛或毛發(fā)雜亂現(xiàn)象。如表4所示，在D，各組小鼠體重?zé)o顯著差異(>0.05)；在D，SCPH組小鼠體重顯著高于B組與MO組體重(<0.05)；D，SCPH組小鼠體重顯著高于B組(<0.05)；在D，SCPH、CPM組小鼠較其他組高，但無(wú)顯著差異(>0.05)；在D，SCPH、CPL組小鼠體重較其余組高，但無(wú)顯著差異(>0.05)；各組小鼠平均日增重?zé)o顯著差異(>0.05)。

表4 各組小鼠的生長(zhǎng)情況(n=10)

2.6 SCP對(duì)酒精損傷小鼠血液生理學(xué)指標(biāo)影響

根據(jù)表5，各組WBC結(jié)果顯示，與B組相比，MO組WBC數(shù)量升高，且高于正常范圍4.63×10～7.63×10個(gè)·L，SCPL、SCPM、CPL和CPH組能夠使WBC恢復(fù)至正常水平(<0.05)；RBC結(jié)果顯示，MO組處于正常范圍9.11×10～13.17×10個(gè)·L，但與B組相比顯著下降(<0.05)，各給藥組RBC數(shù)量均較MO組上升，其中SCPH以及CP各組顯著升高(<0.05)；小鼠PLT正常范圍為762.93×10～1 189.91×10個(gè)·L，而本研究中VC組PLT以及各給藥組均高于正常范圍，這可能是因?yàn)樾坌孕∈驪LT水平會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而增加；HGB正常范圍為141.69～173.81 g·L，MO組HGB低于正常范圍，除SCPM組外，各給藥組可升高HGB至正常范圍；LYM的正常范圍為57%～85%，MO組LYM在正常范圍內(nèi)，但有升高趨勢(shì)，SCPM以及CP各組LYM較MO組顯著下降(<0.05)；HCT的正常范圍為44%～56%，MO組HCT處于正常范圍，但存在下降趨勢(shì)，SCPH組以及CP各組HCT較MO組顯著上升(<0.05)。 SCP能夠恢復(fù)小鼠血液中WBC、HGB至正常水平，一定程度上改善酒精損傷小鼠的血液生理學(xué)指標(biāo)。

表5 各組小鼠的血液生理指標(biāo)(n=5)

2.7 SCP對(duì)酒精損傷小鼠血清生化學(xué)指標(biāo)影響

TG正常生理范圍為1.06～2.20 mmol·L，由表6可知，MO組為(4.10±0.78)mmol·L，顯著高于正常生理范圍(<0.05)，SCPL和SCPM組能夠使TG含量恢復(fù)至正常范圍(<0.05)；TC正常生理范圍為2.86～3.64 mmol·L，MO組為(1.96±0.17)mmol·L，顯著低于生理范圍(<0.05)， 除SCPL和VC組外，各給藥組顯著升高(<0.05)，其中SCPM和SCPH組使TC恢復(fù)至正常范圍，效果最佳；LDH正常生理范圍為1 325.8～2 193.3 U·L，MO組小鼠LDH為(607.25±245.00)U·L，顯著低于生理范圍(<0.05)，SCP和CP均能顯著升高LDH至正常范圍(<0.05)。SCP和CP均能恢復(fù)小鼠血清中TG、TC、LDH至正常水平，改善酒精損傷小鼠的血清生化學(xué)指標(biāo)，其中SCP對(duì)TG和TC的恢復(fù)作用優(yōu)于CP。

2.8 SCP對(duì)酒精損傷小鼠血清免疫因子指標(biāo)影響

由表7可看出，與B組相比，MO組IL-2水平顯著下降(<0.05)，與MO組相比，各給藥組IL-2水平顯著升高(<0.05)，與B組無(wú)明顯差異(>0.05)，其中SCPL、SCPM、CPH組IL-2水平最高；在分泌IL-4水平上，MO組對(duì)比B組顯著升高(<0.05)，各給藥組較MO組顯著降低(<0.05)，其中SCPL、SCPM、SCPH、CPM、CPH組顯著低于VC組(<0.05)，SCP各組的IL-4水平最低；IL-10水平，MO組對(duì)比B組有下降趨勢(shì)，CPL、CPM組較MO組略有升高；各組分泌IFN-γ水平中，與B組相比，MO組顯著下降(<0.05)，與MO組相比，除CPH、SCPL組外，各給藥組顯著升高(<0.05)，與B組無(wú)明顯差異(>0.05)，其中SCPH、CPL組IFN-γ水平最高。SCP各組對(duì)IL-4分泌的抑制作用優(yōu)于CP各組，對(duì)IL-2、IFN-γ分泌的促進(jìn)作用與CP各組無(wú)顯著差異。說(shuō)明SCP和CP對(duì)急性損傷小鼠分泌細(xì)胞因子具有一定調(diào)節(jié)作用，且SCP對(duì)IL-4分泌的抑制作用優(yōu)于CP。

表6 各組小鼠的血液生化指標(biāo)(n=5)

表7 各組小鼠血清細(xì)胞因子水平(n=5)

2.9 SCP對(duì)酒精損傷小鼠臟器指數(shù)影響

如表8所示，與B組相比，MO組小鼠肝臟指數(shù)顯著升高(<0.05)，與MO組相比，各給藥組肝臟指數(shù)顯著降低(<0.05)，且與B組差異不顯著(>0.05)，其中SCPL、CPL、CPM組肝臟指數(shù)最低；各組小鼠心、脾、肺、腎等器官的臟器指數(shù)無(wú)顯著差異(>0.05)。SCP各組對(duì)小鼠肝臟指數(shù)恢復(fù)作用與CP無(wú)顯著差異，說(shuō)明SCP與CP均能改善酒精造成的小鼠急性肝損傷。

表8 各組小鼠的臟器指數(shù)(n=10)

3 討 論

3.1 SCP對(duì)H2O2刺激的巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響

吞噬作用是生物體內(nèi)巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞識(shí)別和吞噬外來(lái)物質(zhì)的功能，是生物體的基本防御機(jī)制。其中，巨噬細(xì)胞能夠參與特異性免疫和非特異性免疫，對(duì)特定的細(xì)胞碎片及病原體進(jìn)行吞噬和消化，并且分泌白介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-12(IL-12)等促炎因子，進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。研究表明，CP可顯著提升小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力，且能顯著提高巨噬細(xì)胞TNF-α和IL-1β的分泌量，促進(jìn)抗體產(chǎn)生，增強(qiáng)小鼠非特異性免疫功能。目前許多研究顯示，硫酸化修飾后的多糖免疫活性增強(qiáng)，如硫酸化枸杞多糖能顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖，提高其吞噬功能，紫菜硫酸多糖可通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同溫度與作用時(shí)間下MO組的細(xì)胞吞噬率均最低，顯著低于B組，表明HO刺激下RAW 264.7細(xì)胞的吞噬作用降低，4 ℃條件下，SCPL、SCPM及CPL組的細(xì)胞吞噬率顯著高于MO組；37 ℃ 條件下，隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)，RAW 264.7細(xì)胞的吞噬率逐漸升高，SCP對(duì)HO刺激下RAW 264.7細(xì)胞的吞噬作用優(yōu)于CP，尤其是SCPL、SCPM組。因此，SCP促進(jìn)細(xì)胞吞噬的效果優(yōu)于CP，這可能是由于SCP促進(jìn)了巨噬細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其向M1型分化，故能顯著提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能。

3.2 SCP對(duì)乙醇刺激小鼠臟器指數(shù)的影響

臟器指數(shù)能夠反映出動(dòng)物機(jī)體中各臟器的生長(zhǎng)發(fā)育情況，間接體現(xiàn)出各臟器的功能強(qiáng)弱、損傷程度，其中肝是動(dòng)物體內(nèi)重要的代謝器官之一。試驗(yàn)第30天，采取乙醇灌胃的方法制造小鼠急性損傷模型。此方法對(duì)于急性損傷的研究領(lǐng)域比較常見(jiàn)，灌胃乙醇后小鼠肝細(xì)胞排列紊亂、出現(xiàn)水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。本試驗(yàn)中，SCP和CP能夠降低肝臟指數(shù)，說(shuō)明SCP與CP能夠緩解乙醇造成的肝損傷。

3.3 SCP對(duì)乙醇刺激小鼠血液生理指標(biāo)的影響

血常規(guī)檢測(cè)是診斷血液疾病的基礎(chǔ)檢查手段，可判斷體內(nèi)炎癥、貧血或凝血等問(wèn)題。WBC、LYM、PLT升高常見(jiàn)于各種感染與炎癥性疾病，RBC、HGB、HCT的降低則表示有貧血、出血等現(xiàn)象。本試驗(yàn)中MO組小鼠血液WBC、LYM水平顯著升高，其中WBC高于正常生理范圍，提示小鼠存在炎癥；RBC、HGB、HCT、PLT水平降低，其中HGB低于正常生理范圍，提示小鼠存在出血、貧血現(xiàn)象。SCP和CP則可以不同程度地改善小鼠血液生理學(xué)指標(biāo)，將WBC和HGB恢復(fù)至正常水平，具有一定的抗炎、促凝作用。其作用機(jī)制可能與抑制白細(xì)胞的產(chǎn)生以及促進(jìn)血小板的產(chǎn)生有關(guān)，從而起到降低體內(nèi)炎癥、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用。

3.4 SCP對(duì)乙醇刺激小鼠血清生化指標(biāo)的影響

血清生化檢測(cè)可反映機(jī)體各器官的代謝水平，用于內(nèi)臟疾病的診斷。TG表示血清中的血脂含量，TG過(guò)高提示肝和腎存在炎癥或損傷。本試驗(yàn)中MO組小鼠TG顯著高于正常生理范圍，而SCP和CP均將其恢復(fù)至正常范圍，從而緩解肝和腎損傷。TC為血清總膽固醇，TC過(guò)低提示存在肝損傷。MO組TC顯著低于生理范圍，除SCPL組外，各給藥組升高TC至正常范圍，改善肝損傷。LDH表示乳酸脫氫酶，廣泛分布于各個(gè)器官，其中心、腎、骨骼肌中含量最豐富。因此LDH異常提示腎或心存在損傷。MO組小鼠LDH顯著低于生理范圍，SCP和CP均能升高LDH至正常范圍，改善腎損傷。本試驗(yàn)中MO組小鼠血清中TG、TC、LDH含量異常，超出正常生理范圍，提示小鼠造模后出現(xiàn)肝和腎損傷，因此，本試驗(yàn)中酒精誘導(dǎo)小鼠急性損傷模型造模成功。SCP和CP均能使TG、TC、LDH恢復(fù)至正常水平，改善急性酒精性損傷小鼠血生化指標(biāo)，其中SCP對(duì)TG和TC的恢復(fù)效果優(yōu)于CP，對(duì)小鼠急性損傷具有保護(hù)作用。

3.5 SCP對(duì)H2O2刺激的巨噬細(xì)胞以及乙醇刺激的小鼠分泌免疫因子的影響

IL-2是一種T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，對(duì)T細(xì)胞的成熟、增殖、分化至關(guān)重要，還可增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性，并促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白。機(jī)體內(nèi)IL-2的表達(dá)失調(diào)與免疫疾病相關(guān)，常作為治療疾病的靶點(diǎn)。研究表明，正常小鼠服用復(fù)方黨參口服液后血清中的-2基因的表達(dá)量顯著升高。硫酸化后的多糖能夠升高免疫抑制型雞外周血IL-2水平，從而提高免疫功能，還能夠顯著提高雛鴨體內(nèi)IL-2水平，提高其抗病毒功能。在本研究中，體外試驗(yàn)結(jié)果顯示，各SCP與CP組的IL-2水平均升高，且與B組無(wú)顯著差異，表明SCP和CP能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞分泌IL-2。在體內(nèi)試驗(yàn)中，SCP和CP能夠顯著提升IL-2水平，其中SCPL及CPH組效果最佳，優(yōu)于VC組。體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果與體外試驗(yàn)結(jié)果相一致。提示SCP和CP可能通過(guò)提高IL-2的分泌量，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖與分化，刺激B細(xì)胞的增殖，從而提高機(jī)體免疫功能。

IL-4是一種來(lái)源于T細(xì)胞的B細(xì)胞生長(zhǎng)因子，可以觸發(fā)Th2細(xì)胞分化、M2巨噬細(xì)胞極化，還能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞表達(dá)抗原，殺死腫瘤細(xì)胞，參與MHCⅡ類抗原的調(diào)節(jié)和FcR的表達(dá)。研究顯示，黨參炮制品能夠降低免疫抑制家兔血清中過(guò)高的IL-4水平。硫酸化后的多糖降低IL-4效果更加顯著，能夠降低雞骨髓源樹(shù)突狀細(xì)胞分泌IL-4水平。在體外試驗(yàn)與體內(nèi)試驗(yàn)中，SCP和CP均能顯著降低IL-4水平，說(shuō)明SCP和CP可能通過(guò)抑制機(jī)體分泌IL-4，降低機(jī)體特異性免疫反應(yīng)，增強(qiáng)非特異性免疫反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)免疫功能；其中SCP各組IL-4水平顯著低于VC組(<0.05)，表明SCP降低IL-4水平作用優(yōu)于CP。

IL-10是一種炎癥與免疫抑制因子，能夠抑制Th1細(xì)胞IL-2和IFN-γ的分泌，抑制IL-22、IL-20、IL-19等促炎細(xì)胞因子、趨化因子和趨化因子受體的表達(dá)。本試驗(yàn)中SCP和CP在一定程度上能夠促進(jìn)IL-10水平，且SCP各組的促進(jìn)效果優(yōu)于CP，與前人報(bào)道一致，說(shuō)明SCP可能通過(guò)抑制促炎因子，緩解機(jī)體炎癥反應(yīng)，起到免疫調(diào)節(jié)作用。

IFN-γ能夠激活巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞趨向于M1型極化，還能夠調(diào)節(jié)癌細(xì)胞和受感染細(xì)胞的免疫狀態(tài)。研究顯示，黨參多糖納米乳灌胃免疫抑制模型小鼠能夠提高其IFN-γ水平。本研究體外試驗(yàn)結(jié)果顯示，SCP和CP能夠顯著促進(jìn)IFN-γ分泌，與前人研究結(jié)果相一致。體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果與體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果相近，其中SCPH組對(duì)IFN-γ分泌的促進(jìn)作用優(yōu)于CP，尤其是SCPH組。說(shuō)明SCP能夠通過(guò)促進(jìn)IFN-γ分泌，刺激巨噬細(xì)胞向M1型分化，增強(qiáng)其吞噬活功能，從而提高機(jī)體的非特異性免疫功能。

4 結(jié) 論

一定濃度的SCP和CP可緩解HO建立的RAW 264.7細(xì)胞急性損傷的細(xì)胞貼壁不良、密度降低、細(xì)胞死亡等現(xiàn)象，促進(jìn)細(xì)胞分泌IL-2、INF-γ，在促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬、抑制細(xì)胞分泌IL-4方面，SCP的效果優(yōu)于CP。乙醇建立的小鼠急性損傷模型中，一定濃度的SCP和CP可升高小鼠血液中RBC、HGB、HCT、PLT含量，降低WBC、LYM含量；升高血清中TC、LDH含量，降低TG含量；提高細(xì)胞因子IL-2、INF-γ分泌水平，降低IL-4分泌水平。在改善血清中IL-4、TG和TC含量方面，SCP效果優(yōu)于CP。