基于蛋白組學體外分析益母草水煎液對補體和凝血級聯通路相關活性因子的作用

張 蒙，王偉然，馮 晨，張 依，張 倩，穆 祥

(北京農學院動物科學技術學院 獸醫學(中醫藥)北京市重點實驗室，北京 102206)

當機體的凝血過程被異常觸發時，心血管系統中流動的血液發生凝集，形成血栓。血栓的形成會引起肺梗死、心肌梗死等各種血栓性疾病，造成機體各組織和器官的壞死。目前，臨床上經常使用抗凝藥物來治療血栓性疾病，但是抗凝藥物或制劑使用過多可造成機體出血、凝血功能障礙等副作用。因此，尋找一種對凝血和抗凝血功能具有雙向調控作用的藥物有助于為獸醫臨床治療血栓和出血提供參考。微血管內皮細胞(microvascular endothelial cells, MECs)作為微血管通透性的主要物理屏障，通過分泌血小板激活因子和黏附蛋白、血栓調節蛋白、纖溶酶原激活劑抑制物和蛋白聚糖等活性因子調控和維持正常血液狀態，是一種具有多種功能的分泌細胞。

益母草歷有“經產良藥”、“血家圣藥”之稱，不僅具有活血通經的功效，還具有一定的止血和凝血作用。iTRAQ技術作為蛋白組學的核心技術之一，具有通量高、重復性好、定量準確的優勢，被廣泛應用在中藥及中藥方劑、中醫證候、藥效評價和藥物安全性的研究中。本實驗室前期研究證明，益母草水煎液可以提高人合谷穴微血管舒縮活動振幅(數據未發表)，所以本研究選取人真皮微血管內皮細胞(human dermal microvascular endothelial cells, HDMECs)通過iTRAQ技術探究益母草水煎液對HDMECs凝血級聯通路相關活性因子的作用，有助于益母草對獸醫臨床血栓和出血相關病癥治療的深入研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料

永生化改造后的人真皮微血管內皮細胞(HDMECs)由獸醫學(中醫藥)北京市重點實驗室留存；益母草(北京同仁堂)，ECM(美國Sciencell)，MTT(美國Sigma)，DMSO(美國Sigma)，血漿去高豐度蛋白試劑盒(美國ThermoFisher)，TiO(日本島津)，反轉錄試劑盒(江蘇康為世紀)，人抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)試劑盒、人凝血酶原片段F2試劑盒購自江蘇雨桐生物科技有限公司，qPCR試劑盒(美國KAPA Biosystems)，TRIzol(美國invitrogen)，TMT標記試劑盒、iTRAQ標記試劑盒、TFA、TEAB、DTT均購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 益母草水煎液的制備

稱取200 g益母草，2 L蒸餾水浸泡30 min，武火煮沸后轉文火煮1 h，過濾倒出藥液；藥渣重復煎煮1次，合并2次藥液，過濾3次，旋轉蒸發儀濃縮至相應濃度(0.49、0.98、1.96、3.92、7.84、15.68、31.36、50.00、62.72、100.00、125.00、500.00和1 000.00 μg·mL)于4 ℃冰箱保存備用。

1.3 MTT法篩選益母草對HDMECs的最大安全濃度

取第10代HDMECs接種于96孔板中，待細胞融合后將細胞隨機分為12組：空白組(僅5%ECM)和各濃度益母草水煎液組(5%ECM+0.49、0.98、1.96、3.92、7.84、15.68、31.36、62.72、125.00、500.00和1 000.00 μg·mL益母草水煎液)。培養24 h后，每孔加入10 μL 5 mg·mLMTT，避光4 h，每孔加入100 μL DMSO，振蕩混勻，在吸光度為490 nm下檢測。

1.4 胰蛋白酶酶解及肽段標記

取第10代HDMECs細胞，分為空白組(僅5%ECM)、50 μg·mL益母草水煎液組(5%ECM+50 μg·mL益母草水煎液)、100 μg·mL益母草水煎液組(5%ECM+100 μg·mL益母草水煎液)，處理24 h后提取蛋白并鑒定，每個樣品取100 μg的蛋白溶液，加入DTT，使其終濃度為5 mmol·L，55 ℃還原30 min。加入碘乙酰胺，使得終濃度為10 mmol·L，室溫避光孵育15 min。加入丙酮沉淀蛋白，-20 ℃放置4 h以上。離心收集沉淀，加入TEAB復溶沉淀，加入胰酶37 ℃消化過夜，隨后凍干，按TMT標記試劑盒和iTRAQ標記試劑盒說明書進行肽段標記反應。

1.5 反相色譜分離與質譜

每份樣品用納升流速Easy-nLC 液相系統進行分離，流動相A相為ACN-HO(2∶98)，流動相B相為ACN-HO(90∶10)，色譜柱為Agilent Zorbax Extend-C18窄徑柱，流速為300 μL·min。待后肽段結束色譜分離后，進行Q Exactive質譜分析。

1.6 熒光定量PCR

取第10代HDMECs細胞，分為空白組(僅5%ECM)、50 μg·mL益母草水煎液組(5%ECM+50 μg·mL益母草水煎液)、100 μg·mL益母草水煎液組(5%ECM+100 μg·mL益母草水煎液)，處理24 h后提取RNA并進行質檢，按照qPCR試劑盒說明書進行相對定量分析。

1.7 ELISA法檢測凝血級聯相關因子

將第10代HDMECs接種至6孔細胞培養板中，待細胞融合后，分為空白組(僅5%ECM)、50 μg·mL益母草水煎液組(5%ECM+50 μg·mL益母草水煎液)、100 μg·mL益母草水煎液組(5%ECM+100 μg·mL益母草水煎液)，24 h后收取細胞上清液，根據AT-Ⅲ和人凝血酶原片段F2試劑盒說明書檢測F2和AT-Ⅲ因子水平。

1.8 數據分析

對篩選得到的差異蛋白進行GO分析和Pathway分析，使用2方法分析熒光定量PCR，其余均使用Graphpad Prism 8.2.0進行兩組間檢驗和多組間ANOVA (one-way analysis of variance) 分析，以*<0.05表示差異顯著，**<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 益母草水煎液對HDMECs細胞活力的影響

如圖1所示，與空白組(Control)相比，不同濃度的益母草水煎液作用24 h后，細胞增殖能力未顯著降低，表明1 mg·mL以下益母草水煎液作用于HDMECs細胞無毒副作用，可以進行后續試驗。

*.P<0.05;**.P<0.01。下同*.P<0.05;**.P<0.01。The same as below圖1 益母草水煎液對HDMECs細胞活力的影響Fig.1 The effect of Leonurus artemisia decoction on HDMECs cell viability

2.2 差異表達蛋白的篩選及鑒定

共鑒定到37 915個肽段、5 792個蛋白。如圖2所示，藍色的點表示下調差異表達蛋白，紅色的點為上調差異表達蛋白，灰色的點為非顯著差異表達蛋白。與空白組相比，50 μg·mL益母草水煎液組的差異表達蛋白有67個，其中上調蛋白27個，下調蛋白40個(圖2A)；100 μg·mL益母草水煎液組的差異蛋白有34個，其中上調蛋白15個，下調蛋白19個(圖2B)。50 μg·mL益母草水煎液組和100 μg·mL益母草水煎液組相比，差異蛋白有61個，其中上調蛋白28個，下調蛋白33個(圖2C)。

A. 50 μg·mL-1益母草水煎液組與空白組差異表達蛋白火山圖；B. 100 μg·mL-1益母草水煎液組與空白組差異表達蛋白火山圖；C. 50和100 μg·mL-1益母草水煎液組差異表達蛋白火山圖A. The differentially expressed protein volcano graph between the 50 μg·mL-1 Leonurus artemisia decoction group and control group; B. The differentially expressed protein volcano graph between the 100 μg·mL-1 Leonurus artemisia decoction group and control group; C. The differentially expressed protein volcano graph in 50 and 100 μg·mL-1 Leonurus artemisia decoction groups圖2 差異表達蛋白火山圖Fig.2 Differentially expressed protein volcano maps

2.3 差異表達蛋白GO富集分析

如圖3A和表1所示，50 μg·mL益母草水煎液組與空白組差異表達蛋白主要富集到生物學過程、細胞組成、分子功能，參與調節細胞外泌體、血管生成、血小板α顆粒、血小板脫顆粒、肝素結合、血小板活化、血液凝固等過程；圖3B和表2所示，100 μg·mL益母草水煎液組與空白組差異蛋白主要富集到生物學功能和細胞組成，參與調節細胞外泌體、血管生成等過程；圖3C和表3所示，50和100 μg·mL益母草水煎液組差異表達蛋白主要富集到生物學過程、細胞組成、分子功能，參與調節細胞外泌體、血管生成、血小板α顆粒、血小板脫顆粒、肝素結合、血小板活化等過程。在上述多個過程中共同影響的蛋白主要為HRG(富含組氨酸的糖蛋白)。

2.4 差異表達蛋白KEGG富集分析

如圖4所示，與空白組相比，50 μg·mL益母草水煎液組差異表達蛋白影響的通路主要有補體和凝血級聯(<0.01)、肌動蛋白和細胞骨架的調節(<0.01)、非洲錐蟲病(<0.05)、瘧疾(<0.05)、膽固醇代謝(<0.05)、癌癥(<0.05)、金黃色葡萄球菌感染(<0.05)、黑色素瘤(<0.05)、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥(<0.05)等(圖4A)；100 μg·mL益母草水煎液組差異表達蛋白影響的通路主要有心肌收縮(<0.01)、肥厚型心肌病(<0.01)、心肌細胞的腎上腺素信號傳導(<0.01)、擴張型心肌病(<0.01)、IL-17信號通路(<0.05)、牛磺酸和牛磺酸的代謝(<0.05)、雌激素信號通路(<0.05)、金黃色葡萄球菌感染(<0.05)、類固醇生物合成(<0.05)、補體和凝血級聯(>0.05)等(圖4B)。與50 μg·mL益母草水煎液組相比，100 μg·mL益母草水煎液組差異表達蛋白影響的通路主要為癌癥(<0.01)、金黃色葡萄球菌感染(<0.01)、肌動蛋白和細胞骨架的調節(<0.01)、雌激素信號通路(<0.01)、補體和凝血級聯通路(<0.01)等(圖4C)。各組兩兩對比差異蛋白影響的共同通路為金黃色葡萄球菌感染、補體和凝血級聯通路?；谝陨辖Y果，猜測益母草水煎液可以通過補體和凝血級聯通路同時調節機體的凝血與抗凝血功能，且其調節作用與益母草水煎液的濃度相關。

A.50 μg·mL-1益母草水煎液組與空白組差異表達蛋白GO富集分析；B. 100 μg·mL-1益母草水煎液組與空白組差異表達蛋白GO富集分析；C. 50和100 μg·mL-1益母草水煎液組差異表達蛋白GO富集分析A. The GO analysis of differentially expressed proteins between Leonurus artemisia decoction group and control group. B. The GO analysis of differentially expressed proteins between Leonurus artemisia decoction group and control group. C. The GO analysis of differentially expressed proteins in 50 and 100 μg·mL-1 Leonurus artemisia decoction groups圖3 差異表達蛋白GO富集分析結果Fig.3 GO analysis results of differentially expressed proteins

表1 50 μg·mL-1益母草水煎液組與空白組的GO富集分析

表2 100 μg·mL-1益母草水煎液組與空白組的GO富集分析

表3 50和100 μg·mL-1益母草水煎液組的GO富集分析

(轉下頁 Carried forward)

A. 50 μg·mL-1益母草水煎液組與空白組差異表達蛋白KEGG富集分析；B. 100 μg·mL-1益母草水煎液組與空白組差異表達蛋白KEGG富集分析；C. 50和100 μg·mL-1益母草水煎液組差異表達蛋白KEGG富集分析A. KEGG analysis of differentially expressed proteins between the 50 μg·mL-1 Leonurus artemisia decoction group and control group. B. KEGG analysis of differentially expressed proteins between the 100 μg·mL-1 Leonurus artemisia decoction group and control group. C. KEGG analysis of differentially expressed proteins in 50 and 100 μg·mL-1 Leonurus artemisia decoction groups圖4 差異表達蛋白KEGG富集分析結果Fig.4 KEGG analysis results of differentially expressed proteins

2.5 補體和凝血級聯通路相關差異因子的分析

對補體和凝血級聯通路篩選到的5種可信差異表達蛋白分析，結果如圖5所示，與空白組相比，50 μg·mL益母草水煎液組F2、AT-Ⅲ、t-PA和KNG的表達量均極顯著降低(<0.01)，F5的表達量顯著降低(<0.05)；100 μg·mL益母草水煎液組AT-Ⅲ和t-PA極顯著降低(<0.01)，F2和KNG顯著降低(<0.05)，F5沒有明顯變化。與50 μg·mL益母草水煎液組相比，100 μg·mL益母草水煎液組F2、AT-Ⅲ、t-PA、KNG的表達量極顯著升高(<0.01)，F5的表達量顯著升高(<0.05)。

A. F2水平；B. AT-Ⅲ水平；C. t-PA水平；D. KNG水平；E. F5水平A. The level of F2. B. The level of AT-Ⅲ. C. The level of t-PA. D. The level of KNG. E. The level of F5圖5 益母草水煎液對可信差異表達因子的影響Fig.5 The effect of Leonurus artemisia decoction on credible differentially expressed factors

2.6 F2和AT-Ⅲ mRNA和蛋白水平

根據蛋白組學結果，選擇拮抗性因子F2、AT-Ⅲ在基因和蛋白水平進行結果驗證。RT-PCR和ELISA結果表明：與空白組相比，50 μg·mL益母草水煎液組2和-Ⅲ的基因表達水平極顯著降低(<0.01)、蛋白表達水平顯著降低(<0.05)(圖6 A、B、C、D)；100 μg·mL益母草水煎液組2基因表達水平差異不顯著(>0.05)、蛋白表達水平顯著降低(<0.01)(圖6 A、C)，-Ⅲ基因表達水平顯著降低(<0.01)、蛋白表達水平差異不顯著(>0.05)(圖6 B、D)。與50 μg·mL益母草水煎液組相比，100 μg·mL益母草水煎液組2基因表達水平顯著升高(<0.05)，蛋白表達水平差異不顯著(>0.05)(圖6 A、C)，-Ⅲ基因表達水平差異不顯著(>0.05)、AT-Ⅲ蛋白表達水平顯著升高(<0.05)(圖6 B、D)。驗證結果與蛋白組學結果趨勢一致。

A. F2基因水平；B. AT-Ⅲ基因水平；C. F2蛋白水平；D. AT-Ⅲ蛋白水平A. The level of F2 genes; B. The level of AT-Ⅲ genes; C. The level of F2 proteins; D. The level of AT-Ⅲ proteins.圖6 F2和AT-Ⅲ的基因和蛋白表達水平Fig.6 Genes and proteins expression level of F2 and AT-Ⅲ

3 討 論

本試驗采用iTRAQ技術對益母草水煎液干預前后的HDMECs進行蛋白組學分析，GO富集分析結果顯示，各組差異蛋白主要被富集到生物學過程、細胞組成和分子功能，參與調節血液凝固、血管生成、細胞外泌體、血小板α顆粒、血小板脫顆粒、肝素結合、血小板活化等過程。血液凝固和纖溶能夠影響血管生成，并且當機體凝血功能受損時，血管生成被激活，加速凝血。Bhakuni等發現抗凝劑如肝素和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖可以有效抑制血管生成，從而發揮抗凝血的作用。細胞外泌體是細胞釋放的一類細胞外囊泡，伴有脂質雙層膜，包含核酸、脂質和細胞特異的蛋白質，可以通過介導特定性細胞之間的通信方式，將與其相互作用或融合的信號通路激活，現有研究也表明，細胞外泌體能夠通過促進血管生成，進而加速凝血。本試驗中益母草水煎液能夠調節血液凝固、細胞外泌體、血管生成中的蛋白，表明益母草水煎液可能通過調節血液凝固和細胞外泌體過程影響血管生成，進而調節機體的凝血與抗凝血功能。血小板α顆粒、脫顆粒、活化均與血小板發揮凝血功能相關，當血小板受致病因素誘發時，會造成其異常黏附，形成血栓。肝素是機體主要的抗凝血物質，能夠加速凝血酶失活進一步抑制血栓。有研究表明，HRG(富含氨基酸的糖蛋白)能夠結合肝素、纖溶酶、纖維蛋白原和活化的血小板等蛋白，并且當其水平過高時會出現血栓性疾病。差異表達蛋白結果顯示，50 μg·mL益母草水煎液組的差異表達蛋白主要與血小板α顆粒、血小板脫顆粒、肝素結合和血小板活化等過程相關，并且在這些過程中共同影響的蛋白主要是HRG，表明益母草水煎液可能通過調控HRG調節血小板α顆粒、血小板脫顆粒、肝素結合和血小板活化等過程進而調節機體凝血和抗凝血功能。

KEGG通路分析表明，益母草水煎液各組對多個通路均具有調控作用，各組兩兩對比差異表達蛋白影響的共同通路為金黃色葡萄球菌感染、補體和凝血級聯通路。本試驗最終篩選出與補體和凝血級聯通路有關的5種可信差異表達蛋白，主要有F2、AT-Ⅲ、t-PA、F5和KNG。凝血級聯具有共同的途徑，該途徑連接內在和外在凝血途徑，活化因子X和輔助因子F5能與鈣、組織、血小板磷脂結合，將F2轉化為凝血酶，從而激活因子XIII并將纖維蛋白原分解為纖維蛋白，使纖維蛋白交聯形成穩定的血凝塊。AT-Ⅲ是肝內合成的一種單鏈α球蛋白，是絲氨酸蛋白抑制家族，AT-Ⅲ作為抑制血栓形成的主要生理物質，在正常生理狀態下可以和肝素結合發揮抑制凝血酶等多種凝血因子活性的作用，其活性的降低促使凝血功能亢進，有利于形成血栓。t-PA是一種能將纖溶酶原轉化成纖溶酶，發揮溶解纖維蛋白原作用的絲氨酸蛋白酶，在預防血栓形成中起著重要作用。KNG能夠抑制血小板的黏附聚集，延緩血栓的形成。本試驗蛋白組學結果表明，與空白組相比，益母草水煎液各組F2、AT-Ⅲ、t-PA和KNG的含量均顯著下調，F2含量降低表明益母草水煎液抑制了凝血酶的生成途徑，發揮了其抗凝血的作用，而益母草水煎液同時抑制AT-Ⅲ和t-PA表明其一定程度上有促進凝血作用。研究表明，凝血途徑的過度激活會降低AT-Ⅲ的水平，還會導致其他凝血因子的過度消耗，所以并不能排除益母草水煎液只是激活了凝血途徑。Fernandes等研究發現，在鉤端螺旋體病患者血清樣本中F2和AT-Ⅲ水平同時降低，推測可能與該疾病期間的出血表現有關，提示機體正處于過度活化凝血狀態，此結果與本試驗結果一致。與50 μg·mL益母草水煎液組相比，100 μg·mL益母草水煎液組F2、AT-Ⅲ、t-PA、F5和KNG的含量升高提示當機體處于過度凝血狀態時，一定濃度的益母草水煎液又能改善這種過度凝血狀態，發揮抗凝作用。因此，凝血與抗凝過程均是由上述因子介導的，兩種因子的平衡偏移決定了機體啟動凝血或抗凝過程。本研究以HDMECs為研究對象探究了益母草水煎液對參與凝血和抗凝血過程相關因子的體外調節作用，雖不能完全模擬體內過程，但根據蛋白組學研究和對具有拮抗性作用的因子的驗證可推測益母草水煎液可能通過補體和凝血級聯通路對機體凝血和抗凝血過程發揮潛在的調節作用，這種調節作用和其濃度相關。

4 結 論

本試驗通過iTRAQ技術研究發現益母草水煎液可顯著改變HDMECs的蛋白表達譜，雙向調節機體的凝血與抗凝血功能，且這種雙向調節作用和濃度相關。調節補體和凝血級聯通路相關因子F2、AT-Ⅲ、t-PA、F5、KNG蛋白的表達可能是其發揮雙向調控作用的機制之一。