利用杏鮑菇殘渣制備D-氨基葡萄糖鹽酸鹽的研究*

崔 瑋，丁玲強，李佩佩，李學艷，騰 琪，李彩霞，李玉蘭

（1.河西學院生命科學與工程學院，甘肅 張掖 734000；2.河西學院實驗動物中心，甘肅 張掖 734000；3.甘肅省張掖市甘州中學，甘肅 張掖 734000）

D-氨基葡萄糖鹽酸鹽 （D-glucosamine hydrochloride，GAH） 呈白色結晶粉末，分子式為C6H13NO5HCl，是甲殼素的一種重要衍生物。氨基葡萄糖化合物類的藥物具抗炎、護肝、參與肝腎解毒等作用[1-2]。目前，GAH大多是利用沿海地區動物甲殼中的甲殼素為原料制備[3]，具有一定的地理和氣候的限制。栽培杏鮑菇（Pleurotus eryngii）時所產生的菌渣中含有大量的菌絲體，而菌絲體細胞壁的主要成分是甲殼素，占細胞壁干重的20%～42%[4]，是生產GAH的理想原料。張掖市甘州區是甘肅省最大的杏鮑菇生產基地，每天均會產生許多杏鮑菇殘渣，而這些殘渣如何進行綜合利用需要引起高度關注。目前，尚未有利用杏鮑菇菌渣制備GAH的相關研究。因此，研究旨在探索杏鮑菇殘渣中制備GAH的理想工藝，為GAH的生產提供新的方法，同時也為提高杏鮑菇殘渣的綜合利用價值提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

杏鮑菇殘渣，于2021年9月由張掖市甘州區張掖市紫家寨農業科技有限責任公司提供。

1.2 試劑和藥品

GAH標準品 (純度≥99%)，北京索萊寶科技有限公司；硝酸銀 (光譜純)，天津市光復精細化工研究所；氫氧化鈉、濃鹽酸、乙酰丙酮、碳酸鈉、鉻酸鉀，國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇、正丁醇、冰醋酸，天津市致遠化學試劑有限公司；對二甲氨基苯甲醛、茚三酮，天津市百世化工有限公司。

1.3 儀器

RE-52AAA旋轉蒸發器，溫州奧利生物醫學儀器廠；AL204電子天平，梅特勒—托利多 (上海)儀器有限公司；JJ-1精密增力電動攪拌器，金壇市城東新瑞儀器廠；DD-5M型大容量離心機，湖南凱達科學儀器有限公司制造；AutopolⅢ-旋光儀，美國魯道夫公司。

1.4 方法

1.4.1 GAH的制備

1） 杏鮑菇殘渣的預處理

預處理時將干燥的杏鮑菇殘渣用2%HCl室溫浸泡12 h以上，除去無機鹽成分，然后用2%的NaOH回流煮沸3 h～4 h，除去蛋白質成分。將經過預處理的原料烘干，粉碎備用[5]。

2） GAH粗品的制備

稱取一定量預處理原料，加入三孔反應瓶，按照一定料液比加入一定濃度的HCl攪拌，保持一定溫度反應一定時間后，將混合液體移入離心管中，2 500 r·min-1離心10 min，取上清液，在沉淀中加入100 mL蒸餾水淋洗沉淀，離心后將上清液和淋洗液合并過濾，將濾液減壓濃縮，待瓶壁析出大量晶體時停止濃縮，將濃縮液與晶體一并轉出，加入過量無水乙醇冷卻至5℃左右過濾得濾渣即為GAH粗品[6]。

3） GAH的純化

采取重結晶法[7]，將粗GAH晶體溶于沸水中，加入適量活性碳，在60℃下連續攪拌1.5 h脫色。然后將溶液趁熱過濾，加入無水乙醇，劇烈攪拌2 h，冷卻至5℃左右過濾收集晶體并干燥得白色結晶粉末。

1.4.2 GAH含量的測定

用改進的乙酰丙酮法[8]和Elson-Morgan方法[9]結合測定樣品溶液中的GAH含量。

1.4.3 杏鮑菇殘渣中GAH得率的測定

GAH得率（G，%） 的計算公式為：

式中：m為實際測得的GAH含量（g）；M為杏鮑菇殘渣質量（g）。

1.4.4 單因素考察及正交試驗

為確定正交試驗的因素與水平，考察了反應時間、反應溫度、鹽酸濃度和料液比 [料液比為質量（g） 與體積（mL） 的比]對GAH粗品得率的影響，分別做3次平行試驗。

根據反應結果及統計分析，每個因素下選擇3個水平做正交試驗。

1.4.5 GAH的層析

采用紙層析法[10]鑒定正交驗證試驗所得最佳提取條件下制備并純化的GAH，展層劑為V（正丁醇）∶V（水）∶V（冰醋酸）=4∶3∶1，混合搖勻分層后棄下層。層析后用茚三酮反應試劑顯色以及Morgan和Elson反應試劑 [V（正丁醇）∶V（水）∶V（冰醋酸）=4∶3∶1]顯色，并計算Rf值，其計算公式為：

式中：s為原點中心至色譜斑點中心的距離（mm）；S為原點中心至展層劑前沿的距離（mm）。

1.4.6 氯離子含量的測定

采用硝酸銀滴定法測定正交驗證試驗所得最佳提取條件下制備并純化的GAH氯離子含量[11]。

1.4.7 GAH樣品及標準品的紅外光譜分析

在相同條件下測定正交驗證試驗所得最佳提取條件下制備并純化的GAH樣品和GAH標準品的紅外光譜圖。

1.4.8 GAH的比旋光度

準確稱取1.00 g GAH樣品，迅速溶解于重蒸水中，定容至50 mL。每隔10分鐘在旋光儀上測定20℃時溶液旋光度，計算出比旋光度，繪制比旋光度隨時間的變化曲線[12]，比旋光度的計算公式為：

式中：α為旋光度（°）；L為旋光管長度（dm）；C為測試樣品的質量濃度（g·mL-1）；D為旋光儀光源鈉光的波長（589 nm）。

2 結果與分析

2.1 單因素水平結果與分析

2.1.1 反應時間對GAH得率的影響

不同反應時間對GAH得率的影響結果見圖1。

圖1 反應時間對GAH得率的影響Fig.1 Effect of reaction time on the yield of GAH

由圖1可知，當反應時小于3.5 h，隨著反應時間的延長GAH得率呈持續上升的趨勢；反應超過3.5 h后，GAH得率開始下降。原因可能是反應時間過長，GAH在水解過程中發生復合與再分解反應[13]。考慮生產效率，選擇3.5 h為最適水解時間。

2.1.2 反應溫度對GAH得率的影響

不同反應溫度對GAH得率的影響結果見圖2。

圖2 溫度對GAH得率的影響Fig.2 Effect of temperature on yield of GAH

由圖2可見，隨反應溫度的升高，GAH得率先增加后降低。溫度過高，導致DAH的復合與分解反應增加，生成一些低聚糖與非糖物質，使成品顏色加深[13]。因此，選擇100℃為反應的最適溫度。

2.1.3 鹽酸濃度對GAH得率的影響

鹽酸濃度對GAH得率的影響結果見圖3。

圖3 鹽酸濃度對GAH得率的影響Fig.3 Effect of hydrochloric acid concentration on the yield of GAH

由圖3可知，當鹽酸濃度較低時，GAH得率隨著濃度的增大而增高，水解加快。鹽酸濃度為30%時，GAH得率較高，而且得到產品的顏色最白。當鹽酸濃度大于30%時，其得率呈下降趨勢。可能是當鹽酸濃度過低時，不易打開酰胺鍵，而鹽酸濃度過高，副反應增多，粘壁碳化現象較嚴重，造成得率、質量下降[13]。因此加入鹽酸的最適濃度為30%。

2.1.4 料液比對GAH得率的影響

料液比對GAH得率的影響結果見圖4。

圖4 料液比對GAH得率的影響Fig.4 Effect of the ratio of material to liquid on the yield of GAH

圖4可知，料液比為1∶6時GAH得率最大。鹽酸作為催化劑和水解反應物，用量過少，體系黏度大，反應不充分，且易造成粘壁，增加副反應且得率較低；但用量過高會給后續處理帶來困難且明顯增加成本，因此最適料液比為1∶6。

2.2 正交試驗結果與分析

通過統計分析料液比、反應溫度、鹽酸濃度以及反應時間4個因素中不同水平對GAH得率的影響，每個因素選擇3個水平，設計了4因素3水平的正交試驗，分析探究制備GAH的理想工藝，其水平因素設計表見表1，正交試驗結果于分析見表2。

表1 正交試驗設計因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiments

表2 GAH制備工藝優化正交試驗結果與分析Tab.2 Results and analysis of orthogonal experiments for GAH preparation process optimization

由表2可知，極差結果R顯示：B>D>A>C，即4個因素中對GAH得率影響順序為：HCl濃度>料液比>反應溫度>反應時間，最佳工藝條件為A2B2C2D2，即在料液比為1∶6、鹽酸濃度為30%、反應溫度為100℃、反應時間為3.5 h時從杏鮑菇殘渣中制備GAH的得率最高。對最佳工藝進行驗證，進行3組平行試驗，GAH的平均得率為5.23%。

2.3 GAH層析分析

根據最佳工藝制備GAH粗品，再采取重結晶法純化，得白色GAH結晶粉末，以此結晶物進行紙層析分析。紙層析圖譜見圖5。

圖5 GAH層析圖譜Fig.5 Paper chromatograms of GAH

由圖5可知，用茚三酮試劑顯色后樣品和標準品均出現一個橘紅色斑點，表明該化合物中含有氨基；用Morgan和Elson試劑顯色后，樣品和標準品也都出現一個紅色斑點，說明有氨基葡萄糖存在。2個GAH樣品斑點的Rf值均為0.34，與GAH標準品的Rf值一致，說明試驗制備的GAH的純度較高。

2.4 氯離子含量

經計算可得，根據最佳工藝從杏鮑菇殘渣制備的GAH（樣品）中，氯離子含量為18.14%，接近于標準品中氯離子含量為16.47%。進一步說明試驗制備的GAH的純度較高。

2.5 紅外光譜分析

在相同條件下分別測定了GAH標準品和根據最佳工藝從杏鮑菇殘渣中制備的GAH樣品的紅外光譜圖，其結果見圖6。

由圖6可知，所制得的GAH產品在3 280.8 cm-1左右的峰是N-H鍵的伸縮振動；2 942.7 cm-1左右峰是C-H鍵的伸縮振動；1 614.8 cm-1左右峰是NH鍵的面內彎曲振動；1 060.5 cm-1左右峰是C-N鍵的伸縮振動；912.8 cm-1左右峰是N-H鍵的面外彎曲振動；與標準品D-GAH紅外光譜圖相吻合。

圖6 紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectrogram

2.6 比旋光度分析

GAH的比旋光度隨時間變化的曲線見圖7。

圖7 GAH溶液（2%）的比旋光度-時間變化曲線Fig.7 The profile of specific rotatory power of GAH solution(2%)versus time

從圖7可以看出，GAH重新溶解于水后出現變旋現象。其剛溶于水時比旋光度值最高，幾乎接近100°，隨著時間的延長，其比旋光度迅速下降，約2 h后，比旋光度趨于穩定，為71.9°。這一現象可能的原因是，用乙醇進行重結晶的過程中，GAH以α形式析出，當其重新溶解于水中后，α型的GAH將向β型轉變，穩定的GAH水溶液是其α型和β型的平衡混合物。

3 結論

試驗研究了杏鮑菇殘渣制備GAH的反應條件對產物得率的影響，重點研究了反應過程中料液比、鹽酸濃度、反應時間和反應溫度對得率的影響。通過對工藝條件的探究，通過正交試驗及分析，確定最佳反應條件為料液比為1∶6、鹽酸濃度為30%、反應溫度為100℃，反應時間為3.5 h，在該條件下GAH的得率可以達到5.23%，經層析、氯離子檢測、紅外光譜和比旋光度分析可知，用該工藝提取的物質為GAH，且純度較高。因此通過杏鮑菇殘渣制備GAH的研究為其制備生產提供了新的方法，從而進一步擴展了制備途徑，同時也為提高杏鮑菇殘渣的綜合利用價值提供理論和必要的試驗依據，為工業化生產提供參考。