灰樹花原生質體高溫脅迫條件研究及其再生菌株的胞外酶活性分析*

王春暉，徐 寧，吳 芳，肖穎群，王小艷，姜性堅，張 宇，胡汝曉**

（1.湖南省食用菌研究所，湖南 長沙 410016；2.茶陵縣興農食用菌種植農民專業合作社，湖南 株洲 412415）

灰樹花 (Grifola frondosa)又名蓮花菌、栗蘑、舞茸等。其以闊葉林木屑為主要營養基質，是典型的木腐真菌。分類上隸屬傘菌綱（Agaricomycetes）多孔菌目（Polyporales） 薄孔菌科（Meripilaceae） 樹花菌屬（Grifola）。90年代我國灰樹花馴化栽培研究取得成功[1]，2000年以來在品種的遺傳多樣性、生物學特性及栽培技術等方面開展了探索[2-3]，不同原產地和不同生態類型的菌株也逐漸增多，促進了我國灰樹花栽培品種及產業化栽培技術的進步發展。灰樹花不僅風味濃香，味道鮮美，具有極高的食用價值，且富含抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等多種活性成分[4-5]，是頗具研究價值與開發潛力的食用菌。

食用菌在無性繁殖過程中種性會出現退化現象[6]，引起菌絲類型變化，雙核菌絲相對減少，單核菌絲相對增多，并伴隨著形態、生理、遺傳等方面的變化和衰退[7]。灰樹花種性退化現象明顯，母種多次無性擴繁，會使菌絲變得纖細、生長速度變緩、抗逆性減弱、原基數量減少、生物學效率降低，影響產量、品質與效益。目前常用組織分離和孢子分離方法進行菌種復壯。組織分離由子實體再生而成，無遺傳因子的重組，復壯效果不好；孢子分離雖有遺傳因子的重組，但遺傳背景復雜，缺乏標記，篩選難度大，復壯時間較組織分離長。

真菌原生質體具有細胞全能性，是遺傳育種的良好材料。許多學者在原生質體分離、再生、誘變、融合等方面開展了大量試驗[8-9]，應用分子生物學技術，取得了一系列研究成果[10]。薛平海等[11]對灰樹花原生質體的制備和再生條件開展了研究；楊軍等[12]獲得灰樹花原生質體單核體，進行了孢子單核體交配型分類與鑒定。關于灰樹花原生質體高溫脅迫條件及其再生菌株胞外酶活性的研究與分析，尚未有相關文獻報道。因此，通過高溫脅迫試驗，揭示灰樹花原生質體高溫脅迫條件以及其再生菌株在胞外酶活性的個體差異，為灰樹花和其他食用真菌品種復壯與選育研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

灰樹花2#，由湖南省食用菌研究所提供。

1.2 藥品與試劑

溶壁酶（Lywallzyme）、纖維素酶（Cellulases）、蝸牛酶（Snailase），由湖南海全醫療科技有限公司提供 （進口分裝）；MgSO4、KH2PO4、K2HPO4、KCl、蔗糖、甘露醇、葡萄糖、蛋白胨，均為國產分析純，由長沙先行化工有限公司提供。

1.3 儀器與設備

LMQ.C-50E蒸汽滅菌鍋，山東博越科學儀器有限公司；TGL-16高速臺式冷凍離心機，湘儀實驗室儀器開發有限公司；BX-53熒光顯微鏡，奧林巴斯（中國）有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺，杭州川一實驗儀器有限公司；HWS-26恒溫水浴鍋，蘇州江東州精密儀器有限公司；FA1204C分析天平，蘇州生物技術有限公司；TS-1102C立式雙層恒溫搖床，長沙市天恒科學儀器設備有限公司；BCD-272WDPD低溫冰箱，海爾智家股份有限公司；Biosafer400up超聲波細胞粉碎儀，湖南遠泰生物技術有限公司。

1.4 培養基配制

普通培養基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖25 g、蛋白胨 2.5 g、MgSO41 g、KH2PO40.5 g、 K2HPO41 g，煮沸10 min，3層紗布過濾，定容至1 000 mL，加瓊脂25 g，用于菌絲體培養。液體培養基：普通培養基不加瓊脂，加羧甲基纖維素納10 g，用于液體菌絲培養。再生培養基：以液體培養基為基液，用0.55 mol·L-1KCl等滲液配制再生培養基（調節滲透壓，保持原生質體形態正常），加0.5%的酵母粉和0.1%的VB1。栽培培養基：木屑70%、玉米芯13%、麥麩10%、腐殖土5%、石膏粉2%，pH 6.0～6.5，含水量60%～65%。上述各類培養基配制后，置高壓蒸汽滅菌鍋內，121℃～126℃、0.11 MPa～0.14 MPa條件下，液體基質滅菌30 min，固體基質滅菌50 min，冷卻至室溫備用。

1.5 試驗方法

1.5.1 原生質體制備

1）菌絲體培養收集

將灰樹花試管種（母種）用普通培養基進行玻璃紙瓊脂平板透析培養，待菌落直徑達到2.5 cm～3.0 cm時，用接種環將菌落邊緣菌絲接入盛有20 mL液體培養基的三角燒瓶中，輕輕擺動接種環，使菌絲分散在液體培養基中，25℃靜置，黑暗培養2.5 d～3.5 d，單層無菌濾紙過濾，0.55 mol·L-1KCl等滲液洗滌 2次～3次，3 000 r·min-1離心10 min，去上清，無菌濾紙吸走多余水分，收集灰樹花菌絲體，4℃～8℃低溫冰箱保存備用。

2） 原生質體分離

根據陸歡等[13]的方法加以改進。稱取纖維素酶1 g、溶壁酶 1.5 g、蝸牛酶 1 g，用 0.55 mol·L-1KCl等滲液溶解，后加入等滲液定容至100 mL配成復合酶液，細菌過濾器（4孔，0.45 μm）過濾后，4℃低溫保存備用；取2 g菌絲體置50 mL三角燒瓶中，加無菌復合酶液10 mL，置于28℃的恒溫搖床中酶解，每隔30分鐘啟動搖床1次，50 r·min-1持續1 min。酶解4.5 h后，用約0.5 cm厚的無菌脫脂棉過濾，過濾液4 000 r·min-1離心15 min，沉淀物用0.55 mol·L-1KCl等滲液溶解，重復離心1次，再將沉淀用等滲液溶解得到原生質體懸浮液。

3） 純度與濃度檢測

用熒光增白劑檢查是否完全去壁，判斷原生質體純度；用血球計數板計算原生質體濃度。測定純度與濃度后快速加甘油超低溫保存。

1.5.2 原生質體高溫脅迫和再生

1）原生質體高溫脅迫

以脅迫溫度和脅迫時間為脅迫參數，按脅迫溫度分成5組，每組設5個脅迫時間、1個對照（CK）。操作方法為：在30個100 mL三角燒瓶內分別注入25 mL再生培養基，高壓滅菌后冷卻至室溫，按無菌操作方法，將分離的灰樹花2#原生質體用0.55 mol·L-1KCl稀釋到 2×104個/mL，在盛有再生培養基的三角燒瓶內分別加入0.1 mL原生質體懸液，分別置42℃、45℃、48℃、51℃、54℃恒溫水浴鍋中，分別處理0（CK）、3 min、4 min、5 min、6 min、7 min。在確定最適脅迫溫度后，根據原生質體致死情況，對0～3 min和7 min～10 min的脅迫時段細分為 0.5 min、1.0 min、1.5 min、2.0 min、2.5 min和 7.5 min、8.0 min、8.5 min、9.0 min、9.5 min，優化脅迫條件，以獲得最適脅迫溫度下對原生質體致死產生響應的最短脅迫時間（剛引起致死）和原生質體能忍受的最長脅迫時間（剛全部致死）。

2） 脅迫原生質體再生

將高溫脅迫后的原生質體置于生化培養箱黑暗靜置培養，培養溫度為26℃～28℃。顯微觀察原生質體再生過程，待培養基中出現可見微小再生菌落，用無菌接種針及時挑出再生菌落，放PDA斜面培養基培養，得到原生質體再生菌株。統計不同脅迫量下的再生菌落數量，并按脅迫條件將再生菌株編號為TtMm-1、TtMm-2、TtMm-3……TtMm-N；各編號中t為脅迫溫度、m為脅迫時間、TM為脅迫條件、N為本脅迫條件下的再生菌株編號。

1.5.3 原生質體高溫脅迫條件篩選

用原生質體致死率衡量高溫脅迫對原生質體活性的影響。通過不同溫度、不同時間的脅迫參數試驗，統計不同脅迫條件下原生質體的致死率，分析在設置的脅迫時間內不同脅迫溫度對原生質體的脅迫程度與致死幅度，確定原生質體的最適脅迫溫度以及該溫度下對原生質體致死產生響應的最短脅迫時間、最長脅迫時間。原生質體致死率（P，%） 依據不同高溫脅迫量條件下原生質體再生菌落的數量計算，計算公式為：

式中：N1為未經處理（CK）的原生質體再生菌落數（個）；N2為高溫脅迫處理后原生質體再生菌落數（個）。

1.5.4 再生菌株的胞外酶酶活力分析

從菌絲濃密、整齊、長速較快且處于最適脅迫溫度下的再生菌株中隨機挑選3個不同高溫脅迫條件的再生菌株，以出發菌株灰樹花2#為對照（CK），進行纖維素氧化酶類及木質素氧化酶類分析。纖維素氧化酶類用羧甲基纖維素酶（CMCase） 為衡量指標，木質素氧化酶類用漆酶（Laccase）為衡量指標。每次試驗5個重復。數據處理以及統計分析采用MATLAB R2019b和Microsoft Excel。因各試驗組之間總體方差不相同，為提高魯棒性并減少第一型錯誤，用Welch’s t-test分析組間差異性。

1） 液體培養菌絲體粗酶液的提取

在250 mL三角燒瓶內分別注入50 mL液體培養基，在121℃、0.11 MPa條件下滅菌30 min。冷卻至室溫后，按無菌操作接入直徑10 mm的菌絲塊2個～3個，搖床避光培養，150 r·min-1，溫度28℃。7 d后置離心管，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液于4℃冰箱低溫保存，作待測酶液備用。

2） 固體培養菌絲體粗酶液的提取

按栽培培養基配方配料、裝瓶、滅菌。冷卻至室溫后，按無菌操作接入直徑1 cm、長度2 cm的斜面試管菌種1塊，25℃培養25 d～30 d，即為原種。待菌絲長滿瓶底后，從中部取帶菌絲的培養基2份，每份30 g。1份用4倍無菌蒸餾水浸泡，超聲波搗碎，20℃浸提8 h，3層紗布過濾，3 000 r·min-1離心10 min，上清液為粗酶液，4℃保存備用。另1份用恒溫干燥箱在60℃～65℃條件下烘干，稱重。

3） 胞外酶酶活力測定方法

漆酶活力測定采用ABTS法[14]。酶活力單位定義為：1 g干培養物（或1 mL菌絲發酵液）中每分鐘使OD600值改變0.01的酶量為一個酶活力單位。

羧甲基纖維素酶測定采用DNS法[15]。酶活力單位定義為：1 g干培養物（或1 mL菌絲發酵液） 每10分鐘催化底物生成1 mg葡萄糖的酶量為一個酶活力單位。

2 結果與分析

2.1 原生質體高溫脅迫條件

不同高溫脅迫條件對灰樹花原生質體致死的影響見表1～表7。

表1 42℃不同時間下原生質體致死率統計結果Tab.1 Lethality rate of protoplasts under different time with 42℃

表2 45℃不同時間下原生質體致死率統計結果Tab.2 Lethality rate of protoplasts under different time with 45℃

表3 48℃不同時間下原生質體致死率統計結果Tab.3 Lethality rate of protoplasts under different time with 48℃

表4 51℃不同時間下原生質體致死率統計結果Tab.4 Lethality rate of protoplasts under different time with 51℃

表5 54℃不同時間下原生質體致死率統計結果Tab.5 Lethality rate of protoplasts under different time with 54℃

表6 48℃下0.5 min～2.5 min時間內原生質體致死率統計結果Tab.6 Lethality rate of 0.5 min-2.5 minprotoplasts under different time with 48℃

表7 48℃下7.5 min～9.5 min時間內原生質體致死率統計結果Tab.7 Lethality rate of protoplasts under 7.5 min-9.5 min conditions with 48℃

由表1及表2可知，分別在42℃、45℃，3 min～7 min脅迫條件下，原生質體致死率為1.47%～63.04%，在設置時間內未能使原生質體全部脅迫致死，可見該脅迫溫度過低。由表4及表5參數可知，在51℃、54℃，3 min～7 min脅迫條件下，原生質體致死率為71.01%～100%，脅迫致死時間為3 min～4 min，致死率幅度大，脅迫時間短、脅迫速度快，可見，該脅迫溫度過高。由表3可知，在48℃，3 min～7 min脅迫條件下，原生質體致死率為40.88%～99.27%，致死幅度與脅迫速度均勻，在設置時間內原生質體接近全部脅迫致死，可見該脅迫溫度（48℃） 為灰樹花2#原生質體高溫脅迫的最適脅迫溫度，該脅迫溫度下原生質體可忍受的最大脅迫量為48℃、7min。由表6可知，在48℃、0.5min～2.5min脅迫條件下，原生質體致死率為0.73%～31.39%，當脅迫時間為0.5 min時，致死率為0.73%，接近對照。可見，該脅迫溫度下可使原生質體致死發生響應的最短脅迫時間為0.5 min。由表7表明，在48℃，7.5 min～9.5 min脅迫條件下，原生質體致死率為100%，7.5 min時原生質體已全部致死。綜合上述結果可得：灰樹花2#原生質體高溫脅迫致死的脅迫條件為48℃、0.5 min～7.5 min。

2.2 再生菌株的胞外酶活性分析

不同高溫脅迫條件下再生菌株的羧甲基纖維素酶活性和漆酶活性見表8和表9。

由表8和表9可知，固體培養的再生菌株T48M3-36、T48M5-19和T48M7-1，以及出發菌株灰樹花2#的羧甲基纖維素酶活性分別為（17.38±1.60） U·g-1、（17.50±1.35）U·g-1、（20.41±2.16）U·g-1、（14.71±1.36） U·g-1，漆酶活性分別為 （69.78±2.54） U·g-1、（69.95 ± 2.71）U·g-1、（73.82±3.10） U·g-1、（64.55 ±2.18） U·g-1；液體培養的羧甲基纖維素酶活性分別為 （27.44±1.826）U·mL-1、（22.70±1.53）U·mL-1、（26.63±2.63）U·mL-1、（19.40±2.25）U·mL-1，漆酶活性分別為 （49.90±2.45）U·mL-1、（49.62±2.62）U·mL-1、（52.67 ± 3.22） U·mL-1、（44.64 ± 1.90）U·mL-1。3個再生菌株的羧甲基纖維素酶活性和漆酶活性均極顯著高于出發菌株灰樹花2#（P＜0.01）。T48M7-1菌株的固體培養基羧甲基纖維素酶活性、液體培養基羧甲基纖維素酶活性和固體培養基漆酶活性高于T48M5-19菌株和T48M3-36菌株，且差異顯著（P＜0.05）。再生菌株酶活高于出發菌株以及再生菌株之間酶活存在差異的原因，可能是高溫脅迫使遺傳因子差、酶活性低、生命力弱的原生質體失活，使遺傳因子優、酶活性高、生命力強的原生質體得以再生，也包括正向突變和重組在內的變異，起到了提純復壯或優化改良作用。試驗結果與王謙等[16]從紅桃側耳（Pleurotus djamor）原生質體再生菌株中篩選出優良菌株以及張運峰等[17]發現平菇（Pleurotus ostreatus） 原生質體再生菌株間的遺傳多樣性存在顯著差異的研究結論相一致。

表8 不同再生菌株的羧甲基纖維素酶活力比較Tab.8 Comparison of CMCase activity in different regeneration strains

表9 不同再生菌株的漆酶活力比較Tab.9 Comparison of laccase activity in different regeneration strains

3 討論與小結

相同條件下制備的原生質體其再生活性存在個體差異，耐熱性好的耐受時間長，耐熱性差的耐受時間短。其原因可能是在原生質體形成過程中，菌絲內的細胞核及細胞器發生隨機分配，產生無核、單核、雙核及多核原生質體，細胞核及細胞器數量的變化，也包括突變和重組在內的變異，使分離后的原生質體在基因組成上產生個體差異，進而引起原生質體在再生活力上的個體差異。分離后的原生質體在基因組成上的個體差異也為其再生菌株在生物學特性上的變異提供了生物學依據。與單核原生質體、同核原生質體及巨大原生質體的研究價值一樣[18-19]，開展原生質體的個性研究，探索原生質體在基因組成、酶系酶活、代謝功能及活力抗性等方面的個體差異，揭示不同原生質體的個體特點、特性和生命規律。可為原生質體在品種復壯、選育及改良上的應用提供更豐富和更精細的研究材料；提高原生質體育種技術的特異性、精準性及高效性。促進原生質體育種技術的不斷深入，具有極大的研究價值和應用潛力。

試驗中探究了灰樹花原生質體高溫脅迫條件及其再生菌株的胞外酶活性。試驗結果與數據分析表明，灰樹花2#原生質體高溫致死脅迫的條件為：最適脅迫致死溫度為48℃，該溫度下使原生質體致死的最短脅迫時間為0.5 min，使原生質體全部致死的最長脅迫時間為7.5 min，脅迫條件為48℃、0.5 min～7.5 min。高溫脅迫下的原生質體再生菌株的胞外酶活性存在個體差異，不同高溫脅迫量下的3個再生菌株的羧甲基纖維素酶活性和漆酶活性均高于出發菌株，且差異極顯著（P＜0.01），不同高溫脅迫量下的再生菌株之間的羧甲基纖維素酶活性和漆酶活性也存在顯著差異（P＜0.05）。