不同方法分離的梯棱羊肚菌菌種的交配型檢測*

鐘 娟，初奕杉，王曉艷，李桂伍，張 平

（湖南師范大學生命科學學院，湖南 長沙 410081）

羊肚菌是羊肚菌屬（Morchella） 所有真菌的統稱，是一類珍稀食用和藥用真菌，具有重要的經濟和科研價值[1]。多基因聯合分子系統發育學研究表明，羊肚菌屬可分為3大類群，分別為黑色羊肚菌類、黃色羊肚菌類和變紅羊肚菌類[2-6]。近年來，我國的羊肚菌栽培產業發展迅速，2019年～2021年全國羊肚菌栽培面積近10 000 hm2[7]。栽培成功的主要為黑色羊肚菌類的一些物種，如梯棱羊肚菌（M.importuna）、六妹羊肚菌（M.sextelata）、七妹羊肚菌（M.eximia）、頭絲羊肚菌（M.exuberans）、歐氏羊肚菌（M.oweri）、Mel-13和Mel-21，其中梯棱羊肚菌的栽培最廣泛[8-10]。

有研究表明，梯棱羊肚菌有性生殖方式為異宗交配[11]。需要2個交配型基因相配的細胞核發生融合后才能完成有性生殖，進而形成子囊果即子實體。菌種是羊肚菌栽培的基礎，只有當菌種同時具有2種交配型時，才能保證有性生殖的進行和子實體的產生。

食用菌菌種分離常用的方法有單孢分離法、多孢分離法、組織分離法、基質菌絲分離法[12]。目前在羊肚菌生產中采用的多為單孢法、多孢法和組織法，基質菌絲分離法很少被采用。不同分離方法獲得的菌種的交配型有所不同，有研究表明單孢法分離的羊肚菌菌株大部分只具有一種交配型（MAT1-1-1或MAT1-2-1）[13-14]，還有研究表明羊肚菌組織分離獲得的菌株存在交配型基因缺失現象[15]。

通過研究采用組織分離法、單孢分離法和多孢分離法3種不同方式分別獲得梯棱羊肚菌的菌種，后采用PCR擴增的方法檢測其交配型基因。此外，研究多次繼代培養對多孢菌絲體交配型的影響。研究結果旨在為梯棱羊肚菌的栽培生產提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試子實體

試驗所用材料：栽培于湖南師范大學真菌研究室羊肚菌栽培基地的梯棱羊肚菌子實體，由2014年采集的野生梯棱羊肚菌（MHHNU 7946）馴化得到。

培養基類型：PDA培養基，配方為馬鈴薯200 g·L-1、葡萄糖 20 g·L-1、MgSO42 g·L-1、瓊脂 18 g·L-1。

試驗所需儀器設備：Motic BA210生物顯微鏡，麥克奧迪實業集團有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；Hirayama HVE-50高壓滅菌鍋，日本Hirayama平山制作所株式會社；DK-98-IIA恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；AUY120電子分析天平，日本島津集團；2.5 μL、10 μL、100 μL、1 000 μL 移液槍、Centrfuge5425 高速離心機和Mastercycler?nexus PCR擴增儀，均為艾本德中國有限公司生產；JY300E電泳儀，北京君意東方電泳設備有限公司；ChemiDoc MP凝膠成像系統，伯樂生命醫學產品公司；單孢分離器等。

試驗所用試劑：Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（產品編號B518259-0100），生工生物工程（上海） 股份有限公司；2×Es Taq MasterMix、6×Loading buffer、DL 2 000 Marker和引物，均訂購于北京擎科新業生物技術有限公司；TAE電泳緩沖液等。

1.2 菌種分離

組織分離法：用該方法進行了5次重復取樣，即選取5個個體健壯、無病蟲害的羊肚菌子實體。將無菌單蒸水沖洗過的子實體縱向剖開，用滅菌手術刀分別從菌蓋內側和菌柄內側削取0.5 cm左右的小塊菌肉組織，置于PDA平板培養基中間位置；每個培養皿只放1塊菌肉，共轉接了10個培養皿；于20℃恒溫箱培養，待培養皿中長出菌落后轉接至試管斜面培養基上。共對10個無污染的組織進行了菌種分離，其中5個分離自菌蓋內側，5個分離自菌柄內側。

單孢分離法：由一個孢子萌發的菌絲體是單孢菌株菌絲體，用該方法共對30個單孢子進行了分離。剪取一塊無病害的成熟羊肚菌菌蓋組織，用鑷子夾碎，然后轉移到裝有玻璃珠和無菌水的三角瓶中，旋轉震蕩制備成孢子懸浮液。用單孢分離器在顯微鏡下分離單孢，具體方法參照參考文獻[16]。將單個孢子置于平板PDA培養基上，待孢子萌發長出菌落，再轉接到試管PDA培養基上繼續培養。

多孢分離法：多孢分離采用鉤懸法，具體方法參照參考文獻[12]。切取一塊成熟羊肚菌菌蓋，子實層朝下掛在鉤上，鉤的另一端掛在三角瓶口上，三角瓶內裝有PDA培養基。靜置12 h，待子囊孢子灑落在培養基表面，取出小鉤，繼續培養2 d～3 d。待孢子萌發長出菌絲，再轉接到試管斜面培養基上。

1.3 多孢菌絲體的繼代培養

多孢菌絲體生長到菌落直徑約3 cm時，在菌落邊緣區域挑取小塊培養基，連同其上的菌絲一起轉接到新的試管斜面培養基上。如此重復轉接，并檢測每一代菌種的交配型基因。

1.4 菌種的交配型基因檢測

DNA提取：取不同菌種分離方法培養5 d的菌種，從斜面培養基上刮取菌核或菌絲用于提取DNA。DNA提取采用試劑盒法，提取方法按說明書進行。

PCR擴增：交配型基因的擴增方法參照參考文獻[13]。PCR反應體積為25 μL，包括12.5 uL的2×PCR Master Mix、9.5 uL的滅菌雙蒸水，濃度為10 umol·L-1的正反引物各1 uL和1uL的DNA模板。引物 MAT1-1-1F/R （5′-3′）：CCGGTTTATCTTACTGGACTGGTTC/GCTTTCCTCTTCTCTCGTTGCCATA，MAT1-2-1 F/R （5′-3′）：CATCTTATTCTGTTAGCCGCCCATC/TACGTGGTGCTCTCGTGCAGATTTT。反應程序為94℃預變性5 min；94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸45 s～60 s，34個循環；72℃延伸7 min；4℃保存。

凝膠電泳檢測交配型基因：每個樣品分別用MAT1-1-1和MAT1-2-1引物擴增，擴增出的MAT1-1-1基因片段約為600 bp，MAT1-2-1基因片段約為1 000 bp。將2次擴增的PCR產物混合，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，置于紫外光透射儀上進行觀察拍照，若觀察到目的條帶就說明樣品具有相應的交配型基因。

2 結果與分析

2.1 組織分離菌種的交配型基因分布情況

組織分離法共分離得到10個菌絲體，其中5個分離自菌蓋內側組織，經檢測均只具有單一交配型基因MAT1-1-1，另外5個菌株分離自菌柄內側組織，也只檢測到單一交配型MAT1-1-1。

2.2 單孢分離菌種的交配型基因分布情況

單孢分離法得到30個梯棱羊肚菌子囊孢子，其中21個孢子萌發產生菌落，其中14個菌株為MAT 1-1-1交配型基因，7個菌株為MAT1-2-1交配型基因。由此可知含MAT1-1-1交配型基因的菌株數量是含MAT1-2-1交配型基因的菌株的2倍。

2.3 多孢分離菌種的交配型基因分布情況

此方法共得到6個多孢菌絲體，分別編號為MS-1～MS-6，經檢測這 6個菌絲體均同時具有MAT1-1-1和MAT1-2-1兩種交配型基因。

2.4 多孢分離菌種多次傳代后交配型的變化

對2.3中6個多孢菌絲體進行多次轉接繼代培養，共轉接了23代。每轉接一代分別檢測其交配型，試驗連續3代確認MAT1-1-1或MAT1-2-1交配型丟失后不再繼續檢測，其結果見表1。

由表1可知，其中MS-1、MS-3、MS-4菌株在轉接到第6代時，其交配型基因MAT1-2-1發生丟失，只剩下MAT1-1-1交配型基因；MS-2在第9代丟失了MAT1-1-1交配型基因；MS-6在第11代丟失了MAT1-1-1交配型基因；MS-5在繼代培養了23代后仍存在MAT1-1-1和MAT1-2-1兩種交配型基因。

表1 多孢分離菌種繼代培養后交配型基因檢測結果Tab.1 Mating type genes results of the subcultures of multi-spore strains

3 結論討論

3.1 梯棱羊肚菌子實體的交配型分布

目前人工栽培的食用菌大多屬于擔子菌，而梯棱羊肚菌屬于子囊菌，其子實體的交配型分布情況較為復雜。杜習慧等[10-11]對梯棱羊肚菌子實體進行了交配型分布檢測，發現多數栽培樣品的菌柄和子實層均由2種交配型構成；而野生樣品交配型分布則不同，僅子實層（可育組織）含2種交配型，而菌柄（不育組織）僅能檢測到1種交配型。在本研究中，無論是從菌蓋內壁還是從菌柄內壁進行組織分離取材，所得菌株都只有MAT1-1-1一種交配型。菌蓋外表面的組織要產生子囊和子囊孢子，必須同時具有MAT1-1-1和MAT1-2-1兩種交配型基因。已有報道分析，羊肚菌有3種不同交配型基因分布方式：菌柄和菌蓋均有2種交配型基因，菌蓋有2種交配型基因而菌柄只有MAT1-1-1交配型基因，以及菌柄和菌蓋均只有MAT1-1-1[11]。再結合相關研究進行分析，認為供試子實體的交配型分布方式為：菌蓋外層同時具有MAT1-1-1和MAT1-2-1兩種交配型，菌蓋內層只有MAT1-1-1一種交配型；而菌柄的內層和外層均只有MAT1-1-1一種交配型。目前對羊肚菌交配型基因研究都只對菌柄或菌蓋進行檢測，而鮮有同時針對菌蓋內側、外側，菌柄內側、外側的交配型基因檢測。本研究提供了更加精準的梯棱羊肚菌子實體的交配型分布圖。當然，研究的供試子實體來自同一個栽培基地，其他產地栽培出的梯棱羊肚菌子實體的交配型分布情況如何有待進一步研究。組織分離是食用菌菌種分離的常用方法之一，出于無菌的考慮，在羊肚菌組織分離過程中通常是將子實體剖開，從子實體內表面取材。結果可能導致分離到的菌種只有一種交配型。劉偉等[15]在進行羊肚菌組織分離時也發現獲得的菌種有一部分只檢測到一種交配型基因。

3.2 梯棱羊肚菌菌種的交配型基因丟失現象

已有研究發現梯棱羊肚菌菌種會發生交配型基因丟失現象[13]，即原本同時具有MAT1-1-1和MAT1-2-1兩種交配型基因的菌種經過一段時間的培養和轉接后，只能檢測出其中的一種交配型。但對于交配型基因丟失的原因尚不清楚。本研究中分離出的6個多孢菌絲體在第一代時均檢測到MAT1-1-1和MAT1-2-1兩種交配型基因。但是，將這6個菌株進行多次轉接，其中3個菌株在轉接到第6代時，丟失了交配型MAT1-2-1，有2個菌株分別在轉接到第9代和第11代時丟失了交配型MAT1-1-1，僅有1個菌株在經過23次轉接后依然具有MAT1-1-1和MAT1-2-1兩種交配型。因此認為梯棱羊肚菌的多孢菌絲體最初包含了多個子囊孢子萌發產生的菌絲，雖然單個子囊孢子只具有1種交配型，但1支試管中具有多個孢子萌發產生的菌絲，即多孢分離法獲得的1個菌株是多個不同孢子萌發產生的菌絲混合物。當對整支試管（菌種） 的交配型進行檢測時，往往可以檢測到2種交配型。這些由不同孢子萌發產生的菌絲在試管中只是混合生長在一起，并沒有發生融合。菌絲在斜面培養基上的生長速度和生長方向各不相同，在菌種轉接時一般從菌落邊緣挑取尖端菌絲。經過反復幾次的操作，可能就只挑取到某一孢子產生的菌絲，這時檢測其交配型也就只能檢測到一種交配型。但這種情況下發生交配型丟失應屬人為操作丟失，而不屬于菌種自身原因造成的交配型基因丟失。

劉萍等[14]用207對具有不同交配型的梯棱羊肚菌菌株進行對峙培養，發現只有1對表現出營養體親和，說明營養體（菌絲）不親和性在梯棱羊肚菌單孢菌株間普遍存在。同時還還發現在供試的6個多孢菌絲體中，有1個菌株在轉接23代后依然具有MAT1-1-1和MAT1-2-1兩種交配型。產生這一現象的原因可能有以下3個方面：1）轉接的代數還不夠，若轉接更多代，最終還是會出現交配型基因丟失；2）在減數分裂過程中偶爾發生錯誤，2個交配型不同的細胞核到同一個子囊孢子中，這樣的孢子長出的菌絲就具有2種交配型，并且不會隨著傳代而發生丟失；3）具有不同交配型的菌絲偶爾發生了融合，融合后的菌絲具有2種交配型，也不會隨著傳代而發生丟失。

3.3 對梯棱羊肚菌栽培生產的指導意義

目前，羊肚菌人工栽培產業在我國發展迅速，但在一些栽培基地會出現出菇少或不出菇的現象[7-9]，給菇農帶來巨大經濟損失，嚴重阻礙了產業的發展。造成出菇少或不出菇的因素有多種，除氣候因素和栽培管理技術的影響外，還有一個重要原因就是菌種交配型基因的缺失。梯棱羊肚菌為異宗結合的真菌，栽培使用的菌種必須同時具有2種交配型，才能保證子實體的形成。研究結果表明，組織分離的梯棱羊肚菌菌種只有一種交配型，若實際應用中使用這樣的菌種，很有可能導致不出菇。單孢分離的菌種也只有一種交配型，若使用一個單孢菌種進行栽培，也可能導致不出菇。但如果將2個或多個具有不同交配型的單孢菌種搭配使用，能在一定程度上減少不出菇的風險。

多孢分離的菌株雖然具有2種交配型，但轉接次數太多會導致某一交配型丟失，因此生產中使用的多孢菌絲體一旦育成新品種，其菌種應該以冷藏或冷凍的方式進行保藏，避免多次傳代，最好每年重新分離。無論是哪種方法分離的菌種，在大規模投入使用前都必須進行交配型基因檢測。交配型基因檢測應該成為制種單位對梯棱羊肚菌菌種進行質量評價的指標之一。