產脂肪酶菌株的篩選鑒定及響應面法優化發酵工藝

秦 昊 劉 凱 鄧文璽 李 珊 于淑萍 王夢圓 郭東會

（山東第一醫科大學生命科學學院，山東泰安 271016）

脂肪酶在人們的生產生活中發揮著重要作用[1]。脂肪酶可以提高一些食品添加劑的脂溶性，如抗壞血酸，從而可以使其更好地應用于脂類食品中[2-3]；在藥物生產中，脂肪酶催化拆分手性藥物[3]；在白酒生產中可以通過脂肪酶催化形成酯類化合物以增添白酒的風味[4]；在制革行業中需要進行脫脂、脫毛等操作，這些操作耗時耗力、人工成本高，若使用脂肪酶可以加快生產速度、減少成本[1]。

脂肪酶來源豐富，廣泛存在于動物、植物和微生物中。其中細菌、真菌和酵母產生的脂肪酶活力很高，而且微生物繁殖迅速，因而具有比動植物源脂肪酶更廣泛的作用pH值和溫度范圍[5-6]。與動植物源脂肪酶相比，微生物產生的脂肪酶成本較低、更易分離純化、生產較為方便等，因而更具有研究價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料。本試驗土樣取自山東第一醫科大學后廚以及泰安油坊富含油脂的土壤，將采集的樣品裝入樣品袋中保存并做好標簽。

1.1.2 培養基與試劑。富集培養基[7]成分為：酵母浸粉0.2g/L、NaCl 0.5 g/L、Na2HPO43.5 g/L、KH2PO41.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L。

篩選培養基[7]：胰蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、NaCl 10 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO40.5 g/L、K2HPO40.5 g/L，pH值7.2～7.4。固體培養基加入1.5%瓊脂，在121℃條件下滅菌20 min。初篩培養基中加入羅丹明B 10 mL/L、橄欖油乳化液12 mL/L。復篩培養基中加入橄欖油乳化液12 mL/L。

發酵培養基[7]：蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 10 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.1 g/L、橄欖油乳化液12 mL/L，pH值6。

種子培養基[8]：葡萄糖20 g/L、胰蛋白胨25 g/L、K2HPO45 g/L、（NH4）2SO45 g/L、MgSO40.5 g/L、橄欖油乳化液10 mL/L。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的富集培養。取10 g土樣溶于90 mL無菌水中制成土壤懸液[9]，以1%接種量接入富集培養基中，28℃、200 r/min搖床培養24 h。連續重復培養3 代。 富集培養液按稀釋倍數為 10-4、10-5、10-6、10-7進行濃度梯度稀釋，取0.1 mL均勻涂布在篩選培養基上，于 28 ℃倒置培養 2～4 d[7，10]。

1.2.2 目標菌株篩選。選取在360 nm紫外光下菌落周圍熒光圈較大的單菌落[11]，并對其劃線分離，直到平板中只存在一種菌落。將分離純化的菌株接入斜面培養基中，保存于含甘油30%的管中，放入4℃冰箱中保存。

1.2.3 菌種鑒定。將脂肪酶含量最高的菌株Youzh-1送去北京睿博興生物技術有限科公司進行16S rRNA測序分析，并進行同源性對比分析，利用MEGA 5.0構建系統發育進化樹。

1.2.4 酶活測定方法。參照文獻[12-13]進行脂肪酶活力測定，并略作修改。

1.3 發酵條件優化

1.3.1 單因素試驗。通過單因素試驗考察培養基中碳源（葡萄糖、NaHCO3、蛋白胨、蔗糖、乳糖）、氮源（硫酸銨、硝酸鈉、尿素、酵母膏、牛肉膏）、溫度（28、30、34、37、40 ℃）、pH 值（5、6、7、8、9）對脂肪酶活性的影響，以確定最適產酶條件。

1.3.2 響應面法優化試驗。在單因素試驗的基礎上，選取4個相關影響因素，并以酶活力作為因變量，利用Design Expert 11.0軟件設計Box-Behnken試驗（4因素3水平），以探究高產脂肪酶菌株的最佳發酵工藝和參數組合并進行驗證試驗。試驗因素和水平如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗因素及水平

2 結果與分析

2.1 高產酶菌株的篩選

從土壤中得到多種菌株，在經過平板初篩及酶活測定復篩之后從中選出具有高產脂肪酶性質的菌株。得到的一株高產脂肪酶菌株為Youzh-1，脂肪酶活力為37.67 U/mL。

2.2 菌種鑒定

選脂肪酶活力最高的菌株Youzh-1經16S rRNA測序分析后，再通過NCBI中的BLAST同源性對比分析，發現在Genbank數據庫中，Youzh-1與Pseudomonas fluorescens菌株ORTB3的16S rRNA同源性為100%。利用軟件MEGA 5.0構建鄰接系統進化樹，Youzh-1與熒光假單胞菌親緣關系最近，可以確定Youzh-1為熒光假單胞菌屬（圖1）。

2.3 單因素試驗優化發酵條件

2.3.1 碳源種類以及碳源添加量對脂肪酶活力的影響。由圖2和圖3可知，在以碳源為葡萄糖時脂肪酶的活力最高，碳源為NaHCO3時脂肪酶活力最低，故最適碳源為葡萄糖。當葡萄糖添加量為5～15 g/L時，脂肪酶活力不斷增大并在葡萄糖添加量為15 g/L時達到最大；當葡萄糖添加量為15～25 g/L時，脂肪酶活力不斷降低。因此，最適葡萄糖添加量為15 g/L。

2.3.2 溫度對脂肪酶活力的影響。從圖4可以看出，當菌株Youzh-1發酵溫度在28～31℃時，脂肪酶活力突然增大；在31～37℃時脂肪酶活力呈不穩定上升趨勢，并在37℃時達到最大；在37～40℃酶活迅速下降。因此，對于Youzh-1菌株來說，菌株最適發酵溫度為37℃。

2.3.3 pH值對脂肪酶活力的影響。從圖5可以看出，菌株Youzh-1產生的脂肪酶活力在pH值5～6范圍內不斷上升，并在pH值為6時達到最大值，在pH值6～9范圍內迅速下降，可見pH值對于脂肪酶活力的影響較大。

2.3.4 氮源種類以及氮源添加量對脂肪酶活力的影響。由圖6和圖7可知，當氮源為牛肉膏時，脂肪酶的活力最高，當氮源為尿素時，脂肪酶活力最低，故最適氮源為牛肉膏。當牛肉膏添加量為5～15 g/L時，脂肪酶活力變化不明顯；牛肉膏添加量為15～20 g/L時，脂肪酶活力急劇升高并在20 g/L時達到最高；當牛肉膏添加量大于20 g/L時脂肪酶活力下降。由此可以看出，牛肉膏添加量為20 g/L時對菌株Youzh-1發酵產脂肪酶最有利。

2.4 響應面法優化發酵條件

2.4.1 Box-Behnken試驗設計及結果分析。利用Design Expert 11.0軟件設計Box-Behnken試驗各因素的響應結果如表2所示。

表2 響應面法優化高產脂肪酶菌株發酵工藝試驗結果

利用Design Expert 11.0對表2的試驗結果進行分析，得到以酶活大小作為響應值的回歸方程為：Y=85.06+6.70A+7.40B+2.97C+0.6337D-6.40AB-1.97AC-1.53AD+0.3025BC+1.01BD-3.09CD-8.91A2-0.67B2-11.87C2-10.45D2。

2.4.2 回歸模型方差分析。對回歸模型進行方差分析，如表3所示。模型的P值＜0.000 1，表明本試驗選用的二次多項模型極顯著；失擬項P=0.301 3＞0.05，不顯著，表明模型與試驗數據擬合度好，誤差小；相關系數R2=0.932 6，表明了試驗值與預測值的擬合性較好，能夠較真實地模擬曲面；模型的校正決定系數R2Adj=0.865 2，表明該模型可以解釋86.52%的變化。從方差分析結果可以看出，4個因素對脂肪酶活性的影響作用從大到小依次為B＞A＞C＞D。

表3 高產脂肪酶菌株發酵條件回歸模型方差分析

2.4.3 發酵條件各因素相互作用分析。從圖8可以看出，隨著葡萄糖和牛肉膏的增加脂肪酶活力呈先增大后減少的趨勢，而且從其等高線圖中可以看出，葡萄糖添加量一側的等高線較陡，說明葡萄糖添加量對脂肪酶活力影響較牛肉膏添加量對脂肪酶活力的影響更明顯；隨著葡萄糖添加量和溫度增加脂肪酶活力呈先增大后減少的趨勢，而且從其等高線圖中可以看出，葡萄糖添加量一側的等高線較陡，說明葡萄糖添加量對脂肪酶活力影響較溫度對脂肪酶活力的影響更明顯；隨著牛肉膏添加量和溫度增加，脂肪酶活力呈先增大后減小的趨勢，而在其等高線圖中可以看出，牛肉膏添加量與溫度的等高線圖近似于圓形，說明牛肉膏添加量與溫度對于脂肪酶活力的交互作用不太明顯；隨著牛肉膏添加量和pH值的增加，脂肪酶活力呈先增大后減小的趨勢，從其等高線圖中可以看出，二者的等高線圖近似于圓形，說明二者對于脂肪酶活力的交互作用不明顯；隨著葡萄糖添加量和pH值增加，脂肪酶活力呈先增大后減少的趨勢，而且從其等高線圖可以看出，葡萄糖添加量一側的等高線較陡，說明葡萄糖添加量對脂肪酶活力影響較pH值對脂肪酶活力的影響更明顯；隨著溫度和pH值的增加，脂肪酶活力呈先增大后減小的趨勢，而且從其等高線圖可以看出，pH值一側的等高線相對于溫度一側較為密集，說明pH值較溫度對脂肪酶活力的影響明顯。

2.4.4 發酵條件響應面優化驗證試驗結果。在模型預測的培養基最優配比條件下進行發酵試驗，預測的脂肪酶活力理論最大值達到87.19 U/mL。通過響應面法得到優化后的發酵條件為葡萄糖添加量18.825 g/L、牛肉膏添加量25.98 g/L、溫度41℃、pH值6，在此條件下進行發酵試驗驗證，測定脂肪酶活力為79.87 U/mL，較模型預測理論值87.19 U/mL減少了8.39%，證明模型可靠。

3 結論與討論

脂肪酶作為生產生活中重要的酶之一，現已有越來越多的研究者對其進行多方面的研究。將菌株用于工業生產，都必須先對其發酵條件進行優化[14]。因此，在工業上通過優化發酵工藝提高酶產量來壓縮生產成本有著重要意義[15]。

本文在單因素試驗的基礎上采用響應面法對熒光假單胞菌的發酵條件進行進一步優化設計，得到最佳發酵工藝為葡萄糖添加量18.825 g/L、牛肉膏添加量25.98 g/L、溫度41℃、pH值6，在此條件下測得脂肪酶活力為79.87 U/mL，較理論值87.19 U/mL減少了8.39%，證明模型可靠。微生物來源的脂肪酶具有易生產、易于分離純化、產量高等特點，可以在工業生產中利用微生物發酵生產脂肪酶，下一步可就菌株遺傳改良進行研究，以提高脂肪酶活力。