環糊精修飾的氟苯尼考PLGA納米粒的制備及其體外釋放評價

何怡嬌，李姝琪，高崇凱，易 軍，李曉芳，吳 芳，林博璇，鄧 洵，黃智龍，郭波紅*

(1.廣東藥科大學藥學院，廣州 510006；2.廣東潤華藥業有限公司，廣東 揭陽 515500)

氟苯尼考(florfenicol, FF)是一種硫代苯酚的氟化物類似物，是一種對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌均有效的廣譜獸用抗生素，具有無潛在再生障礙性貧血作用等優點[1]，被廣泛應用。但是，FF的水溶性差，生物利用度低，血漿半衰期縮短，給藥后迅速釋放，這些缺點給臨床應用帶來很多不便[2-3]。因此，采用聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA]作為載體材料來改善氟苯尼考成藥性缺陷，PLGA納米粒可以提高藥物在體內的穩定性，延長藥物體內作用時間，減小藥物的副作用，提高藥物溶解度和生物利用度。

因材料本身的局限性，單一的納米載體材料往往會產生穩定性較差，突釋效果明顯，靶向作用較弱等缺點[4]。將親水性包覆材料與疏水性納米材料相結合可避免這種缺點，疏水性的納米材料作為內核可以裝載藥物，提升藥物的溶解度，親水性物質進行包覆的外層可保護內部的藥物，可以延長藥物半衰期，控制藥物的釋放，提高藥效以達到期望的治療效果[5-7]。環糊精(Cyclodextrins, CDs)是一種外表面親水、內腔疏水的環狀低聚糖，可通過疏水側鏈與藥物相互作用形成包合物，從而提高藥物的溶解度[8]。它與PLGA結合形成的共聚物，可以減少初始爆破釋放，延長藥物在體內的停留時間來達到長循環的目的，通過不斷釋放活性物質發揮藥物儲層的作用，提高親水性和穩定性，可以提高其載藥能力來提高藥效，顯示出在藥物輸送系統方面的巨大潛力[9-11]。

選用生物相容性好的PLGA作為制備納米粒的載體材料，采用親水性包覆材料2-羥丙基-β-環糊精(2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin, 2-HP-β-CD)對納米粒進行修飾，利用簡單易行的乳化溶劑揮發法，單因素試驗考察及正交設計優化FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs，并研究2-HP-β-CD對納米粒粒徑與電位、包封率、體外釋放等的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器 安捷倫1200高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司)；KQ2200DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；PRACTUM124-1CN電子天平(德國賽多利斯科學儀器有限公司)；SCIENTZ-ⅡD超聲波細胞粉碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；DelsaTM Nano C 粒徑分析儀(美國 Beckman Coulter公司)；PKZ-1電熱恒溫振蕩水槽(上海精密實驗設備有限公司)；旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 材料 FF原粉(99.50%，山東國邦藥業股份有限公司)；FF 對照品 (含量 99. 90 %，批號: K0301703，中國獸醫藥品監察所)；聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA，LA/GA=50/50，相對分子量：10000/20000；LA/GA=75/25，相對分子量：10000/20000，山東省醫療器械研究所)；聚乙烯醇(PVA，德國Sigma-Aldrich公司)；2-HP-β-CD(美國Sigma Aldrich公司)；葡聚糖凝膠(Sephadex G-50，北京索萊寶科技有限公司)；透析袋，MWCO：8000～14000(廣州市齊云生物技術有限公司)；乙腈、甲醇(色譜純，Dikma公司)；二氯甲烷、丙酮(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

1.3 FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs的制備 采用改進的乳化-溶劑揮發法[12]，精密稱取一定量的FF和PLGA，溶解于適量的丙酮：二氯甲烷(3:2)的混合溶劑中構成有機相，探頭超聲(超聲功率為380 W)作用下將上述溶液緩慢滴加到含有PVA和2-HP-β-CD的水相中，繼續超聲一定時間得白色乳液，旋轉蒸發除去有機溶劑，然后經0.22 μm微孔濾膜過膜整粒，即得FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs。

1.4 FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs制備工藝的單因素試驗

1.4.1 乳化劑濃度篩選 固定其他制備條件保持不變，改變處方中的PVA濃度，將PVA濃度依次設置為1%，2%，3%，4%，根據“1.3”項下制備方法，測定FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs包封率的情況。

1.4.2 藥脂比篩選 固定其他制備條件保持不變，改變藥脂比分別為1∶2，1∶5，1∶10，1∶20，根據“1.3”項下制備方法，測定FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs的包封率的情況。

1.4.3 藥物濃度篩選 固定其他制備條件保持不變，改變處方中FF濃度依次為1.5 mg·mL-1，2.0 mg·mL-1，2.5 mg·mL-1，3.0 mg·mL-1，根據“1.3”項下制備方法，測定FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs包封率的情況。

1.4.4 2-HP-β-CD濃度篩選 固定其他制備條件保持不變，改變處方中2-HP-β-CD濃度依次為1%，1.5%，2%，2.5%，根據“1.3”項下制備方法，測定FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs包封率的情況。

1.5 正交試驗設計優化 在單因素試驗考察的基礎之上，本試驗選取PVA濃度(A)，藥物與PLGA用量比(B)，FF濃度(C)，2-HP-β-CD濃度(D)四個因素，固定有機相與水相體積比為1∶8，采用L9(34)正交設計表進行正交試驗，進一步優選出FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs制備處方。

表1 正交試驗水平因素表Tab 1 Orthogonal test level factors table

1.6 FF含量測定

1.6.1 色譜條件 色譜柱：DIKMA Diamonsil?C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流動相：乙腈∶水=35∶65(V/V)；檢測波長：224 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣體積：20 μL。

1.6.2 方法學考察 精密稱定干燥的FF對照品適量置于10 mL容量瓶中，用流動相配制成濃度為500 μg·mL-1的FF對照品儲備液。精密量取FF對照品儲備液適量，用流動相稀釋配制成為10、30、50、80、100 μg·mL-1的標準溶液，按“1.6.1”項下條件進行分析測定(進樣經0.22 μm微孔濾膜過濾)。配制低、中、高濃度FF對照溶液，一天內重復測定 6 次，連續測定 3 d，計算日內和日間精密度及 RSD值，另取空白納米粒分別加入低、中、高濃度FF對照溶液，加適量乙腈充分振搖破乳， 用流動相定容后經微孔濾膜過濾測定，計算回收率。

1.7 包封率測定方法 精密吸取FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs膠體溶液0.5 mL，加樣于Sephadex G-50柱(1.3 cm×25 cm)，用蒸餾水洗脫，棄去前10 mL，收集游離藥物部分20 mL，60 ℃水浴揮干，殘渣用流動相溶解，定容至10 mL，微孔濾膜過濾后取20 μL，進樣測定，代入回歸方程計算W游離。另取0.5 mL置10 mL量瓶中，加入適量乙腈充分振搖破乳，用流動相定容，微孔濾膜過濾后取20 μL進樣測定，代入標準曲線計算W總，計算FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs的包封率。

包封率=(1-W游離/W總)×100%

W總：總藥物量，W游離：游離藥物量

1.8 FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs的粒徑與Zeta電位觀察與測定 取適量FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs膠體溶液置于DelsaTM Nano C激光粒度分析儀，測定粒徑，多分散指數(polydispersity index, PDI)和Zeta電位。

1.9 體外釋放行為研究 體外釋放研究在磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS，pH7.4)中通過透析法進行[13]，具體方法如下：將含有游離FF或FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs(相當于FF 2 mg)的樣品溶液加入截留分子量為8000～14000的透析袋中，將透析袋兩端密封，放入含有PBS釋放介質的錐形瓶中，并放入電熱恒溫振蕩水槽中37 ℃恒溫振蕩。按預定的時間間隔，吸取2 mL釋放介質按照“1.6.1”方法進行分析，并添加2 mL新鮮PBS緩沖液。測定FF累積釋放量，并且計算累積釋放率。結果一式三份，以累積釋藥百分率(%)為縱坐標對時間(h)為橫坐標作圖。

為進一步闡明FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs的釋藥特性，對FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs分別采用零級動力學方程、一級動力學方程、Higuchi 方程、Ritger-peppas方程和Weibull方程進行擬合。具體方程如下：

零級級動力學方程:Q=Kt

一級動力學方程:ln(1-Q)=-Kt/2.303+lnM

Higuchi方程:Q=Kt1/2

Ritger-peppas方程:Q=Ktn

Weibull方程:lnln(1/(1-Q/100))=mlnt-lnt0

其中Q為累計釋放百分數，K為釋放速率常數，t為時間，M為常數，n為擴散系數，m為形狀參數，t0為尺寸參數。

1.10 數據統計與分析 所有試驗至少重復3次，數據以“平均數±標準差”表示，使用SPSS13.0統計軟件進行統計分析，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 乳化劑濃度篩選 結果表明，當PVA濃度由1%增加到2%時，納米粒的包封率由37.23%逐漸升高至61.07%，但繼續增加PVA濃度至4%時，其包封率下降至36.48%。原因可能是在一定范圍內PVA濃度的升高提升了乳化效果，使納米粒產率增加；但當PVA濃度繼續增大，會使藥物更容易擴散到水相，致使包封率開始下降。因此可選擇PVA濃度范圍為1.5%～2.5%。

2.2 藥脂比篩選 結果表明，當藥脂比由1∶2增加至1∶10時，納米粒的包封率由29.48%逐漸升高至59.75%，但繼續增加藥脂比至1∶20時，其包封率下降至53.75%可能是當PLGA濃度逐漸提高時，納米粒的產率也逐漸增加，使包封率提高；其濃度過高會導致膠體溶液黏度過高，形成團聚，導致包封率減小。因此可選擇藥脂比范圍為1∶10～1∶20。

2.3 藥物濃度篩選 結果表明，隨著藥物濃度由1.0 mg·mL-1增加至1.5 mg·mL-1時，納米粒的包封率由43.39%升高至64.47%，但當繼續增加藥物濃度至2.5 mg·mL-1時，其包封率下降至35.25%。原因可能是當藥物濃度較小時，溶液中藥物含量低，不利于藥物被包封。隨著藥物濃度的升高，溶液藥物含量也逐漸增大，包封率也隨之逐漸升高。但當藥物濃度超過一定量之后，有機相的黏度也增大，在水中難以分散，導致包封率下降。因此選擇藥物濃度范圍為1.0-2.0 mg·mL-1。

2.4 2-HP-β-CD濃度篩選 結果表明，隨著2-HP-β-CD濃度由1.0%升高至2.5%時，FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs的包封率呈逐漸下降的趨勢。這可能是因為當FF為一定濃度時，2-HP-β-CD的存在有利于提高FF的溶解度，使其更容易向水相中分散，而難以被疏水性的PLGA包封。因此選擇2-HP-β-CD濃度范圍為1%～1.5%。

2.5 正交試驗設計及結果 正交試驗結果(表2)表明，藥脂比對包封率影響最為顯著，其次為PVA濃度，而藥物濃度對包封率影響相對較小，4個因素對包封率的影響程度由大至小可排列為：B>A>D>C。

表2 正交試驗結果及直觀分析表Tab 2 Orthogonal test results and visual analysis table

進一步將影響因素最小的C組作為誤差組進行方差分析(表3)，發現B因素不同水平間存在顯著性差異(P<0.05)，為主要影響因素；A、D因素不存在顯著性影響，為次要影響因素。綜合直觀分析與方差分析結果，本試驗確定最優處方為A2B3C2D3，即處方中PVA濃度2%，藥物與PLGA用量比1∶15，藥物濃度2.0 mg·mL-1，2-HP-β-CD

表3 正交試驗設計方差分析Tab 3 Analysis of variance of orthogonal test design

濃度為1.5%。按上述最優處方制備3批樣品FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs，并以包封率為評價指標，按照“1.7”項下的包封率測定方法，測得平均包封率為(82.02 ± 0.82)%，說明處方的重現性較好且工藝穩定可行。

2.6 FF含量測定結果 以峰面積(A)對濃度(C, μg·mL-1)進行線性回歸，得線性擬合回歸方程：A=41.211 C+1.553，其中r=0.9999。根據數據說明FF在10 μg·mL-1～100 μg·mL-1濃度內與峰面積線性關系良好。方法學考察表明：在本色譜條件下，高中低三種濃度溶液的平均回收率為99.96%，RSD為0.52% (n=9)，日內精密度RSD=0.73%(n=6)，日間精密度的RSD=0.27% (n=3)，均符合測定要求。

2.7 FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs的粒徑與Zeta電位觀察與測定 根據DelsaTM Nano C激光粒度分析儀的測定，FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs的粒徑為(185.90 ± 2.80) nm(圖1A)，PDI值為0.10 ± 0.05，Zeta電位為(-5.92 ± 1.80) mV(圖1B)，其電位為負值，可能與粒子表面的環糊精上的羥丙基有關。其外貌形態如圖1A所示，表現為半透明乳光狀溶液。

圖1 FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs 外貌，粒徑及電位(A為粒徑，B為電位)Fig 1 FF-2-HP-β-CD-PLGANPs appearance, particle size and potential (A is particle size, B is potential)

2.8 體外釋放行為的研究 體外釋放研究在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH值7.4)中通過透析法進行，結果如圖2所示，FF的累積釋放率遠高于FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs組，約4 h即可完全釋放，而FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs組4小時內僅釋放(37.85±1.36)%，FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs的釋放速率明顯較FF慢且平穩(P<0.05)。后期可持續平穩釋放至72 h，其累積釋放率為(82.08±1.71)%。說明2-HP-β-CD的加入可作為納米粒的保護層，阻礙了FF從內核向外擴散，有助于藥物的緩慢釋放。

圖2 FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs體外釋放曲線Fig 2 FF-2-HP-β-CD-PLGANPs In Vitro Release Profile

體外釋放擬合方程結果如表4所示，根據其相關系數判斷，FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs擬合效果最符合Ritger-peppas方程，擬合方程為lnQ=0.417lnt+2.794，R2=0.9655，其中n=0.32(<0.5)，屬于Fick擴散控制藥物釋放。

表4 FF-2-HP-β-CD-PLGA NPS的體外釋放擬合方程及相關系數Table 4 Fitting equation and correlation coefficient of in vitro release of FF-2-HP-β-CD-PLGANPS

3 討論與結論

3.1 包封率測定方法的選定 本文采用改進的乳化-溶劑揮發法，以PLGA作為載體材料，PVA為乳化劑，脂溶性氟苯尼考為模型藥物，利用2-HP-β-CD對其進行修飾，以包封率作為評價納米粒制備工藝的主要指標，選用合適的方法對其進行準確測定。包封率常用的方法有透析法，低溫高速離心法、超濾法、微柱離心法、葡聚糖凝膠柱色譜法[14]等。采用葡聚糖凝膠柱色譜法，此法利用具有網狀結構的葡聚糖凝膠的分子篩作用，可將納米粒膠體溶液中的大分子量納米粒與小分子量游離藥物完全分離。

3.2 PLGA種類對包封率的影響 試驗前期，本文首先考察了PLGA種類對FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs包封率的影響，分別選用LA/GA為50/50與75/25，分子量分別為10000與20000的PLGA制備納米粒，結果當LA/GA比值相同時，分子量越大，包封率越高[15]。當分子量較高時(分子量：20000)，提高LA的比例，會使體系黏度過高，反而不利于藥物的包封，導致包封率降低，因此本文選用LA/GA為50/50，分子量為20000的PLGA進行單因素試驗考察和正交試驗設計。

3.3 2-HP-β-CD加入方法對包封率的影響 在前面試驗的基礎上，考察了2-HP-β-CD的加入方法對包封率的影響。方法1：先制備FF/2-HP-β-CD包合物，再與乳化劑混合作為水相[16]；方法2：將2-HP-β-CD直接加入含有乳化劑的水相中混勻。結果發現方法2制備的納米粒包封率較高，可能的原因是2-HP-β-CD與乳化劑的共同作用，提高了體系的穩定性和包封率[17]。方法1中FF進入環糊精內腔形成包合物后，增強了FF在水中的分散性，難以進入疏水性載體材料中，造成其包封率偏低。隨著2-HP-β-CD濃度的升高，FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs的包封率呈逐漸下降的趨勢。這可能是因為當體系中FF為一定量時，2-HP-β-CD的存在起到了助溶作用，用量越高，助溶效果越好，使其更容易向水相中分散[8]。

3.4 體外釋放結果 體外釋放結果表明FF-2-HP-β-CD-PLGA NPs較FF原藥有明顯的緩釋作用，且可持高濃度平穩釋放。可能是由于納米粒外層有2-HP-β-CD的保護，所以FF沒有那么快從孔道中釋放出來，這與文獻中描述結果相符[18]。所以當載體材料表面包覆一層親水性物質如2-HP-β-CD，可以避免納米粒子的吸附或降解，延長了藥物的循環時間，提高藥物的溶解度與穩定性，控制藥物的釋放，達到更好的治療效果。

3.5 結論 本試驗選用親水性材料環糊精修飾氟苯尼考PLGA納米粒，通過單因素試驗，正交試驗優化篩選出最優處方為：PVA濃度2%，藥物與PLGA用量比1∶15，藥物濃度2.0 mg·mL-1，2-HP-β-CD濃度為1.5%。該處方制備的納米粒的平均包封率為(82.02±0.82)%，體外釋藥具有緩釋行為。