QuEChERS-超高效液相色譜-質譜聯用法測定熊膽粉中9種苯二類藥物殘留量

王小喬，許曉輝*，張虹艷，馮 翀, 2，吳福祥，潘秀麗，李 赟

(1.蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院，蘭州 730050；2.蘭州理工大學生命科學與工程學院，蘭州 730050)

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent 1290 UPLC/6460C超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜聯用儀，配有電噴霧離子源(美國安捷倫科技有限公司)；Vortex-genie2渦旋混合器(美國Scientific)；H1850離心機(湖南湘儀)；MS105DU分析天平(梅特勒-托利多)；Milli-Q超純水系統(美國Millipore公司)；SBL-10DT超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司，功率為300 W)；GENO2010組織研磨儀(美國SPEX)。

1.2 試劑 甲醇、乙腈、乙酸乙酯(色譜純，德國Merck公司)；甲酸、乙酸銨(色譜純，東京化成工業株式會社)； EMR-Lipid dSPE 凈化管(美國安捷倫科技有限公司)；硫酸鈉、氯化鈉(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。對照品：馬來酸咪達唑侖(批號：171250-201002；純度：99.9%)、艾司唑侖(批號：171219-201003；純度：99.7%)、奧沙西泮(批號：171229-201505；純度：99.8%)、硝西泮(批號：171217-201403；純度：99.9%)、勞拉西泮(批號：171253-201102；純度：99.2%)、阿普唑侖(批號：171218-201305；純度：99.5%)、氯硝西泮(批號：171227-201404；純度：99.9%)、三唑侖(批號：171230-201203；純度：99.6%)、地西泮(批號：171225-200903；純度：99.9%)均購自中國食品藥品檢定研究院；熊膽粉樣品購自中藥材市場。

1.3 溶液制備

1.3.1 EDTA-Mcllvaine緩沖液 稱取檸檬酸8.4 g，Na2EDTA 19.5 g，磷酸氫二鈉7.1 g，溶于650 mL水中，超聲溶解。

1.3.3 供試品溶液的制備 提取：取熊膽粉樣品適量，研細，混勻；精密稱取熊膽粉約1 g置于50 mL離心管中，加入3 mL EDTA-Mcllvaine緩沖液，加入1粒陶瓷均質子，振蕩搖勻，再加入乙腈10.00 mL，在組織研磨儀上振蕩渦旋5 min，在300 W功率下超聲提取5 min，加入含4 g 硫酸鈉和1 g 氯化鈉的萃取鹽包，再渦旋2 min，在4 ℃下以4000 r/min速率離心15 min，取上清液待凈化。

凈化：精密移取上述上清液2.00 mL于EMR-Lipid dSPE凈化管中，渦旋1 min，在4 ℃下以4000 r/min離心15 min，取上清液過0.22 μm濾膜，供液相色譜-質譜聯用儀測定。

1.4 色譜-質譜條件

1.4.1 色譜條件 ACQUITY BEH C18色譜柱(1.7 μm，2.1×100 mm)；流動相：以含0.1 %甲酸-2 mmol/L乙酸銨的水溶液為流動相A，以含0.1%甲酸的乙腈溶液為流動相B，梯度洗脫程序：0～3.0 min，10%～30%B；3.0～5.0 min，30%～90%B；5.0～7.0 min，90%B；7.0～8.0 min，90%～10%B；8.0～9.0 min，10%B。柱溫：35 ℃；進樣量： 2 μL；流速：0.3 mL/min；分析時間：9 min。

1.4.2 質譜條件 電離源：噴射流電噴霧離子源(AJS ESI)；離子源模式：正離子模式；采集方式：多反應監測模式(MRM)；干燥氣：N2；干燥氣流量：8 L/min；干燥氣溫度：325 ℃；霧化氣壓力：45 psi；毛細管電壓：4000 V；鞘流氣流量：12 L/min；鞘流氣溫度：350 ℃，相關質譜采集參數見表1。

2 結果與分析

2.1 前處理條件優化

2.1.1 提取溶劑的選擇 本實驗分別選擇甲醇、乙腈、乙酸乙酯為提取溶劑，以相同水平濃度的9種目標分析物加標對應回收率為依據，按照1.3.3和1.4項下條件進行前處理和上機分析，考察提取溶劑的提取效果。結果表明，以甲醇為提取溶劑時，回收率處于15%～56%之間，且大多數目標分析物的回收率小于40%；以乙酸乙酯為提取溶劑時，回收率處于51%～180%之間，且除硝西泮之外，其余目標分析物回收率普遍偏高；以乙腈為提取溶劑時，目標分析物的回收率整體較好，這可能是乙腈對目標分析物具有較好的溶解性，同時能很好地沉淀蛋白質，去除雜質比較充分，整體上降低了基質的干擾(圖1)。因此，最終選擇乙腈為提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑對9種苯二類藥物提取效率的影響Fig 1 Influence of different extraction solvents on theextraction efficiency of nine benzodiazepine drugs

2.1.2 凈化方法的選擇 由于熊膽粉樣品基質中含有較多熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸、膽酸、去氧膽酸及少量脂肪和蛋白質，這些類別的雜質會在提取過程中進入提取液，在分析目標化合物時會產生基質效應，對檢測結果造成干擾，這些雜質大部分是脂溶性的，因此需要采用高脂類凈化方式來除雜，而增強型脂質去除分散固相萃取凈化管(EMR-Lipid dSPE)是專門為多脂樣品中脂質性雜質的選擇性凈化而設計，因此，本實驗選擇EMR-Lipid dSPE方式進行凈化。

2.2 色譜質譜條件優化

表1 9種苯二類藥物檢測離子對及相關參數Tab 1 Ion pairs and related parameters for nine benzodiazepine drugs

2.3 基質效應 本實驗通過取空白樣品，按照前處理方法制備成空白樣品基質溶液，再分別用空白樣品基質溶液與純溶劑配制成相同濃度的對照品溶液，以兩者同一藥物質譜響應值比值的百分數來評價基質效應(Matrix Effect，ME)，若ME大于100%，則存在基質增強效應；若ME小于100%，則存在基質抑制效應；若ME接近100%，則不存在基質效應，本實驗設計了兩個濃度級別10 ng/mL和30 ng/mL，結果發現，9種化合物在10 ng/mL的條件下，除勞拉西泮存在基質效應增強效應外，其余分析物存在一定程度的基質抑制效應，其中基質抑制效應最強的是咪達唑侖和硝西泮；在30 ng/mL的濃度下，艾司唑侖、奧沙西泮、阿普唑侖存在一定程度的基質增強效應，其余待測物存在不同程度的基質抑制效應。雖然各待測物存在不同程度的基質效應，但不影響檢測結果(圖2)。

圖2 9種苯二類藥物的基質效應Fig 2 Matrix effect of nine benzodiazepine drugs

表2 9種苯二類藥物的線性關系、檢出限和定量限Tab 2 Linear relationship, LOD and LOQ of nine benzodiazepine drugs

2.5 回收率及相對標準偏差考察 取空白樣品，分別按10、50、100 μg/kg 添加3個水平的混合對照品溶液，考察方法的回收率和日間、日內相對標準偏差(RSD)。每個添加水平制備平行樣6份，在1.3.3項和1.4項條件下進行前處理和上機分析，計算相應的回收率與相對標準偏差(Relative Standard Deviation，RSD)，結果顯示，在3個加標水平下，9種目標分析物的加標平均回收率為69.1%～108.0%，日內RSD為1.8%～9.0%，日間RSD為2.6%～9.3%(表3)。

表3 9種苯二類藥物的平均回收率與相對標準偏差(n=6)Tab 3 Average recovery and RSD of nine benzodiazepine drugs(n=6)

3 討論與結論