獸用雞源和豬源轉移因子與免疫活性相關的多肽分析

黃迪海，盛曉丹，劉 霞，黃 兵，亓麗紅，張再輝，秦卓明,*

(1. 山東省健牧生物藥業有限公司，濟南 250100；2. 濟南市動物生物藥品工程技術研究中心，濟南 250100；3. 山東省農業科學院家禽研究所，濟南 250100)

轉移因子(Transfer Factor，TF)是由動物淋巴細胞產生的小分子物質，能夠將供體的特異性免疫信息遞呈給受體淋巴細胞，使其致敏從而激發受體細胞介導的免疫反應，在國內主要作為免疫增效劑使用，對于天然免疫和獲得性免疫均有一定的免疫調節作用[1]。動物脾轉移因子一般含有多肽、核糖、氨基酸、核苷酸、微量元素等多種成分，商品化的TF口服溶液通常把多肽、核糖含量作為質控指標，但缺乏相應的理論支撐。目前，有關脾轉移因子多肽成分的研究報道較少[2]，尤其是缺乏多肽種類、功能及其序列的研究。為此，本文應用質譜色譜法(LC-MS)對獸用雞脾和豬脾TF的多肽進行鑒定，篩選與免疫相關的多肽進行比較和分析，為轉移因子及多肽藥物的研發提供思路和參考。

1 材料與方法

1.1 材料 獸用雞脾TF、獸用豬脾TF，由山東省健牧生物藥業有限公司通過凍融、透析法制備，多肽含量≥1 mg/mL，核糖含量≥30 μg/mL；Millipore 10 kD超濾離心管。

1.2 方法 TF溶液用10 kD超濾管10000 r/min離心處理，收集通過的濾液，冷藏；委托中國科學院上海生命科學研究院進行蛋白質鑒定，按照文獻[1]的方法，進行溶液內酶解(Trypsin，20 h)，抽提酶解肽段，應用LC-MS法采集多肽碎片的質量電荷比，應用BIOWORKS軟件搜索相應的數據庫，得到鑒定的蛋白質結果，查詢Uniprot數據庫，篩選具有免疫活性的蛋白質。

2 結果與分析

2.1 蛋白質與多肽的鑒定概況 獸用雞脾和豬脾TF分別檢測到多肽片段656條和1194條，對應蛋白質512種、554種，包含有特征的蛋白448種、485種，其中，與免疫相關的蛋白分別有30種、40種(表1)。

表1 雞脾和豬脾TF中的多肽及其分子量分布Tab 1 Peptides and their molecular weight distribution in chicken spleen-derived and pig spleen-derived TF

此外，多肽片段對應的完整蛋白還具有生長發育調節、生物酶解、營養代謝以及維持細胞結構和運動等多種活性。

2.2 免疫活性蛋白質及多肽序列

2.2.1 細胞免疫作用 在雞脾和豬脾TF中，與細胞免疫活性相關的蛋白質共21種蛋白。其中，雞脾有8種、豬脾有16種，二者均含有淋巴細胞胞質蛋白(LCP)、白細胞介素-16(IL-16)和胸腺肽β4(TMSB4X)3種蛋白。在細胞免疫的感應階段，涉及9種蛋白，其中，雞脾2種，豬脾7種(表2)。在細胞免疫的反應階段，共涉及11種蛋白，其中，雞脾5種，豬脾6種(表3)。在效應階段，共涉及4種蛋白，其中，雞脾1種，豬脾3種(表4)。

表2 TF中與細胞免疫感應階段有關的多肽Tab 2 Peptides in TF associated to the cellular immune sensing phase

表3 TF中與細胞免疫反應階段有關的多肽Tab 3 Peptides in TF associated to the stage of cellular immune response

續表

表4 TF中與細胞免疫效應階段有關的多肽Tab 4 Peptides in TF associated to the effector stage of cellular immunity

2.2.2 體液免疫 參與體液免疫調節的蛋白有11種，其中，雞脾有6種，豬脾有5種，二者均含有烯醇酶(ENO1)(表5)。

表5 TF中與體液免疫有關的多肽Tab 5 Peptides involved in humoral immunity in TF

2.2.3 其他免疫調節作用

2.2.3.1 先天免疫 涉及先天免疫調節作用的有15種蛋白，其中豬脾有9種，雞脾有7種，二者均含有甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(表6)。

表6 TF中與先天免疫有關的多肽Tab 6 Peptides involved in innate immunity in TF

續表

2.2.3.2 多種免疫活性 涉及多種免疫調節作用的有9種蛋白，其中，雞脾有4種、豬脾有5種，二者均含有信號轉導轉錄激活因子(STAT1)(表7)。

表7 TF中與多種免疫有關的多肽Tab 7 Peptides associated with multiple immunity in TF

2.2.3.3 抗腫瘤活性 涉及多種免疫調節作用的有9種蛋白，雞脾4種，豬脾5種(表8)。

表8 TF中與抗腫瘤有關的多肽Tab 8 Polypeptides associated with antitumour in TF

續表

3 討 論

TF中的多肽成分比較復雜，相關研究尚處于探索階段。Kirkpatrick C H[3]制備了牛源和鼠源特異性TF，測序發現其均含有多肽LLYAQDL/VEDN，且能抑制受體遲發性超敏反應的表達。黃靜芳等[4]在豬脾臟制備的脾氨肽口服凍干粉中鑒定出胸腺肽β4，占其多肽總量的0.117%。陳艷菊等[5]從抗乙肝TF中分離到多肽與核苷酸的復合物，該多肽由15種氨基酸組成。本文通過對獸用雞脾和豬脾TF的多肽鑒定，確定了其含有的潛在免疫活性多肽的氨基酸序列，其氨基酸數量為5～24個，多肽分子量為599.2784～2507.8258 Da。這些多肽對應70余種免疫相關蛋白質，其中，雞脾和豬脾蛋白分別占其總蛋白數的5.86%和7.22%，二者均含有IL-16、TMSB4X、LCP、ENO1、GAPDH、STAT1等六種蛋白質。多肽序列對相關蛋白質的覆蓋率為0.29%～81.2%，其中，覆蓋率較高的是胸腺肽β4(81.2%)和抗菌肽(31.54%)。結合黃靜芳的報道，推斷胸腺肽是TF的主要成分之一，但不同工藝制備的TF，其多肽成分、含量有所差異，可能與脾臟來源、粉碎細度、凍融次數、透析或超濾的孔徑和時間等因素有關。

研究發現，TF的免疫活性蛋白質中，涉及細胞免疫21種、先天免疫15種、體液免疫11種、多種免疫活性8種、抗腫瘤9種，這些蛋白主要通過某些信號通路發揮作用，如：TCR或BCR介導的信號通路、非受體酪氨酸激酶信號途徑、JAK-STAT、cGAS-STING、及NF-κB信號通路等。

研究表明，某些活性肽可以口服發揮免疫調節作用，比如：脯-甘氨酸環二肽[6]、膠原三肽[7]、牡蠣肽[8]、胸腺蛋白肽[9]、環孢素A等。研究發現，多肽口服進入胃和小腸，有的被消化酶、氨肽酶等降解為游離氨基酸和小肽；有的不被降解，通過細胞緊密連接的細胞旁路徑、被動擴散、內吞作用或載體轉運系統被小腸吸收[10]。進入細胞的小肽一部分被胞漿中的肽酶水解為游離氨基酸，用于細胞本身代謝合成或被運至體循環；一部分具有抗水解酶活性的多肽可直接通過基底側的肽轉運體完整地轉運至體循環發揮作用，后被血漿中的可溶性蛋白酶降解為氨基酸[11]。雞脾和豬脾轉移因子中含有免疫活性蛋白的多肽片段達100多種，但尚不能確定哪些多肽片段具有口服免疫活性，還需要進一步通過多肽合成和免疫學試驗研究來證實。

除多肽外，TF中還包含核糖、微量元素、游離氨基酸以及核苷酸等多種成分。其中核糖在TF中的含量不低于30 μg/mL，核糖是RNA的組成物之一，也是ATP及NADH等生化代謝所需分子的原料，因其分子量較小，一般不具備免疫原性；微量元素和游離氨基酸是基本營養代謝所需，鋅、銅具有一定的免疫調節作用，但其含量僅有0.49 μg/mL和0.04 μg/mL[12]，正常劑量難以發揮免疫功能。TF中核苷酸含量達200～300 μg/mL[13]，其免疫活性成分可能是尿嘧啶類化合物[14]，錢微等[15]也證實了對早期玫瑰花結形成具有顯著促進作用的TF成分中含有鳥苷酸、尿嘧啶和尿苷。TF中的核苷酸可能具有口服免疫活性，因為外源食物DNA在小鼠胃腸道中是不完全降解的，其堿基片段可在小鼠進食后的8 h在血液中檢測到，24 h內可在淋巴細胞中檢出，24 h后發生降解[16]。外源DNA口服后，經非序列依賴性DNA結合蛋白內吞入細胞核，一部分發生降解，未降解的DNA則插入細胞基因組DNA中，可能導致某些外源基因的表達，也可能被機體通過甲基化方式進行控制和清除[17]。TF中的核苷酸主要來自脾臟本身，也可能來自脾臟攜帶的微生物，其種類和序列有待于應用PCR擴增和高通量測序方法進行鑒定，進而研究其體內外的生物活性。