基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜在動物源細菌耐藥性監測中的研究應用

丁曉妍，崔明全，李 霆，朱馨樂，張純萍，程 敏，趙 琪，王鶴佳

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

我國是畜牧業大國，涉及動物種類繁多，養殖基數大，需要獸用抗菌藥物為動物健康和食品安全保駕護航。可是隨著抗菌藥物的廣泛使用，“細菌耐藥性出現→過量使用或濫用抗菌藥物→耐藥譜或耐藥水平加重”的惡性循環仍在繼續[1]。為了遏制動物源細菌耐藥性，2018年，我國開始開展獸用抗菌藥使用減量化行動試點，其中，相關養殖場細菌流行和耐藥情況備受關注[2]。大腸桿菌和腸球菌分別被認定為革蘭氏陰性和革蘭氏陽性耐藥水平指示菌[3]，耐藥性水平指示菌在一定程度上代表了該養殖場的細菌耐藥水平，是細菌耐藥性監測中關注的重要對象。目前，我國動物源細菌耐藥性監測中細菌分離鑒定多采用生化和PCR鑒定方法[4]。針對不同養殖場不同類型的細菌分別鑒定，程序不一，工作量大，迫切需求高效的細菌鑒定技術手段。基于細菌特異性蛋白圖譜的基質輔助激光解析電離飛行時間質譜技術具有快速、簡單、高通量、準確性高、穩定性好等特點，可以滿足細菌耐藥性監測中細菌鑒定的需求，而且MALDI-TOF鑒定微生物的方法已經成為全球臨床微生物實驗室細菌分離株常規鑒定的參考方法[5]。MALDI-TOF技術基本原理為：將微生物樣品與基質分別點加在鋼靶上，晾干后形成共結晶，發射激光，基質吸收激光能量幫助樣品分子電離，經過飛行時間檢測器進行信號檢測，生成質譜圖，縱坐標為離子峰，橫坐標為離子質荷比(m/z)[6]。通過采集2000～20000 kD區間的微生物蛋白指紋圖譜，掃描每個物種的特征峰值，與大型數據庫中標準圖譜進行匹配，能夠鑒定細菌種屬[7-8]。本研究通過選擇MALDI-TOF方法，快速有效地鑒定雞、牛和羊來源的大腸桿菌和腸球菌臨床分離菌株，開展細菌耐藥表型檢測，以期待為臨床細菌耐藥性監測工作提供技術支撐和參考依據。

1 材料和方法

1.1 樣品 分別從五家獸用抗菌藥使用減量化試點(兩家雞場來自寧夏某養殖場和湖南某養殖場，一家羊場來自浙江某養殖場，兩家牛場分別來自寧夏某養牛場和河南某養牛場)進行抽樣，每個養殖場15份樣品，總共75份樣品。標準菌株為大腸桿菌ATCC25922和糞腸球菌ATCC29212。

1.2 試劑與儀器 運送培養基、大腸桿菌顯色培養基、腸球菌顯色培養基、普通營養瓊脂(青島海博生物有限公司)；甲酸；乙腈；無水乙醇；CHCA基質溶液；臺式冷凍離心機：德國Sigma公司；基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀：島津公司；VITEK-2全自動微生物鑒定儀、濁度儀、革蘭氏陰性鑒定卡(GN)和革蘭氏陽性鑒定卡(GP)：梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集與細菌分離 采集不同養殖場動物(雞、牛和羊)糞便、設施表面和工人鼻腔拭子樣品，立即放入無菌運輸培養基中保存，低溫運送至實驗室。

分離純化：將保存在運送培養基中的樣品分別在大腸桿菌顯色培養基和腸球菌顯色培養基上劃線，置于37 ℃恒溫培養箱中培養18～24 h。挑取大腸桿菌顯色培養基上的藍綠色單菌落(疑似大腸桿菌)和腸球菌顯色培養基上的紅色或紫色的單菌落(疑似腸球菌)再次在顯色培養基上劃線進行二次純化。

將質控菌株大腸桿菌ATCC25922和腸球菌ATCC29212復蘇，在普通營養瓊脂上劃線，37 ℃培養18～24 h。

1.3.2 MALDI-TOF MS 鑒定 樣品前期處理：挑取純化后的疑似單菌落在普通營養瓊脂培養基上劃線培養。用無菌接種環挑取適量樣品于1.5 mL離心管中，加入300 μL純水和900 μL無水乙醇，混勻，12000 rpm/min，離心2 min，棄去上清；向沉淀中加入50 μL70%甲酸，混勻，再加入50 μL乙腈，混勻，12000 rpm/min，離心2 min，留上清。質控菌株ATCC25922的處理同上。

點樣：先在干凈的鋼靶上點1 μL上清，放干后再點2 μL CHCA基質溶液，晾干后送入上樣系統。

MALDI-TOF 鑒定：選擇儀器運行模式Linear_saramis，設置掃描范圍2000～20000，激光頻率20；激光能量66，采集譜圖數Profiles 100，shot 2，Blank 1500，PμLsed Extraction 8330；利用Auto quality自動獲得譜圖。設置好參數后開始采集質控菌株ATCC25922的數據，進行校準。校準完成后開始進行樣品數據采集。

數據處理：將導出txt格式的數據拷貝到數據庫電腦的鑒定軟件中自動讀取數據并鑒定。鑒定結果給出科、屬、種三個水平。

1.3.3 VITEK 2 生化鑒定 挑取適量的分離純培養的菌株于3 mL的0.45%無菌鹽水中混勻，用VITEK 2 比濁儀配置相當于0.5～0.63麥氏單位的菌懸液。將懸浮液管及GN、GP卡置于載卡臺上，連接菌液管和鑒定卡，放入儀器中，按照VITEK全自動生化鑒定系統操作流程進行樣品鑒定。

1.3.4 細菌耐藥表型檢測 采用微量肉湯稀釋法測定大腸桿菌和腸球菌對抗菌藥物的耐藥性，測定大腸桿菌對氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、慶大霉素、四環素、磺胺異噁唑、復方新諾明、頭孢他啶、氧氟沙星、美羅培南、黏菌素的耐藥表型，腸球菌對青霉素、紅霉素、萬古霉素、苯唑西林、多西環素、利奈唑胺的耐藥表型。參照美國臨床實驗室標準化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標準[9]進行結果判定。大腸桿菌和腸球菌分別用ATCC25922和ATCC29212進行質控。

2 結果與分析

2.1 細菌鑒定結果 針對湖南、寧夏、河南和浙江地區進行樣品采集的75份樣品(雞養殖場采集30份，牛養殖場30份，羊養殖場15份樣品)，將棉簽拭子樣本分別在大腸桿菌顯色平板和腸球菌顯色平板劃線過夜培養。大腸桿菌典型菌落為藍色，邊緣整齊，表面濕潤的圓形菌落，腸球菌典型菌落為紅色至紫色，邊緣整齊，表面濕潤的針尖樣菌落。針對上述疑似大腸桿菌或腸球菌進行MALDI-TOF MS鑒定，大腸桿菌分離率為41.33%(31/75)，腸球菌分離率為45.33%(34/75)(糞腸球菌14株，屎腸球菌18株、海氏腸球菌2株)(圖1和表1)。

圖1 樣品的MALDI-TOF MS譜圖Fig 1 MALDI-TOF MS spectrum of the samples

表1 不同動物來源的細菌分離情況Tab 1 Isolation of bacteria from different animal sources

VITEK生化鑒定結果中，31株被鑒定為大腸桿菌，34株被鑒定為腸球菌，結果與MALDI-TOF MS結果一致。

2.2 細菌耐藥性結果

2.2.1 大腸桿菌耐藥性檢測結果 藥敏試驗結果顯示(圖2)，三種動物來源分離獲得的大腸桿菌均對四環素高度耐藥(100%)；雞、牛和羊源大腸桿菌對氨芐西林(91.67%、27.27%、75%)、阿莫西林/克拉維酸(58%、0、37.5%)、磺胺異惡唑(83.33%、18.18%、75%)表現出不同程度耐藥性，而且雞源大腸桿菌的10種抗菌藥物中的5種藥物(阿莫西林/克拉維酸、慶大霉素、四環素、磺胺異惡唑、復方新諾明)的MIC50比牛或羊源的大腸桿菌高。雞源、牛源和羊源大腸桿菌多重耐藥率分別為90.9%、36.36%和87.5%，雞和羊源大腸桿菌表現五重耐藥性(β-內酰胺類、氨基糖苷類、四環素類、磺胺類抗、喹諾酮類)，牛源大腸桿菌表現四重耐藥性(β-內酰胺類、四環素類、磺胺類抗、喹諾酮類)。由此可見，雞源大腸桿菌耐藥情況最為嚴重。

圖2 大腸桿菌的生化反應結果Fig 2 The resμLt of the biochemical reaction of E. coli

圖3 腸球菌的生化反應結果(a:糞腸球菌；b:屎腸球菌；c:海氏腸球菌)Fig 3 The resμLt of the biochemical reaction of Enterococcus

圖4 不同動物來源的大腸桿菌耐藥情況Fig 4 Resistance of E. coli from different animal sources

2.2.2 腸球菌耐藥性檢測結果 從藥敏試驗結果得出，雞源、牛源和羊源腸球菌對青霉素(3.45%、0、0)、紅霉素(55.17%、22.73%、28.57%)、多西環素(51.72%、4.55%、9.09%)、苯唑西林(62.07%、36.36%、9.09%)和利奈唑胺(27.59%、0、21.43%)表現出不同程度的耐藥性，雞源腸球菌對上述5種抗菌藥物的耐藥率普遍高于牛和羊源腸球菌的耐藥率。而且雞源腸球菌的6種藥物中的3種抗菌藥物(紅霉素、多西環素、利奈唑胺)的MIC50比牛或羊源的腸球菌高。三種動物來源均表現多重耐藥現象。其中，雞源腸球菌多重耐藥率為100%，對β-內酰胺類、大環內酯和四環素三類抗菌藥物耐藥，牛源和羊源腸球菌多重耐藥率分別為77.78%和66.67%，均對大環內酯、四環素和β-內酰胺類三類抗菌藥物耐藥。藥敏試驗結果顯示雞源腸球菌耐藥性最為嚴重。

圖5 不同動物來源的腸球菌耐藥情況Fig 5 Resistance of Enterococcus from different animal sources

3 討 論

本研究采用MALDI-TOF MS鑒定細菌的方法，減少了不同細菌不同的檢測程序和步驟，高效地實現了對不同動物源的大腸桿菌和腸球菌的臨床鑒定。目前，MALDI-TOF MS作為快速鑒定的熱點應用技術被廣泛采納應用于國內外臨床微生物臨床檢測研究。國家標準委發布了《GB/T 33682-2017基質輔助激光解析電離飛行時間質譜鑒別微生物方法通則》，美國臨床和實驗室標準協會發布《Methods for the Identification of CμLtured Microorganisms Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry》，表明MALDI-TOF MS已經成為微生物菌種鑒定的標準方法。利用已知菌種建立數據庫，通過質譜檢測獲得蛋白指紋圖譜，與數據庫中的參考圖譜對比后得到鑒定結果，這種方法已經廣泛應用到臨床上微生物的物種水平鑒定。Rychert等[10]對1146份革蘭氏陽性菌的樣品進行處理，經MALDI-TOF鑒定出1063份樣品，種水平準確率為92.8%，屬水平準確率達95.5%；Faron等[11]采集2263份革蘭氏陰性菌進行MALDI-TOF鑒定，結果表明種屬水平分別為98.2%、99.8%。這說明MALDI-TOF MS在革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌中都具有很高的準確性和可信性。Koziel等[12]結合MALDI-TOF和16S rRNA鑒定出獼猴糞便中存在CIT 045(T)解脲彎曲桿菌。MALDI-TOF MS 也可以作為溯源分析手段，Jadhav等[13]將MALDI-TOF MS作為檢測食品和食品加工環境中的單核細胞增生性李斯特菌的鑒定和溯源手段，溯源結果與金標準脈沖電場技術具有良好的一致性。除此之外，MALDI-TOF MS也可以直接被應用于臨床耐藥菌株相關的特征峰鑒定，從而實現對耐藥菌株的直接檢測。Wang等[14]利用耐藥相關特征峰值的不同來檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，通過直接尋找MRSA與MSSA對比的特征峰(m/z891、1140、1165、1229、2127)，確定其為MRSA。Lau等[15]利用MALDI-TOF MS分析耐藥性相關質粒(攜帶碳青霉烯酶基因blaKPC的pKpQIL質粒)，結合蛋白質組學和分子生物學技術鑒定表征了與pKpQIL質粒的基因產物相對應的m/z11109 Da峰，實現耐藥菌的快速鑒定。

值得注意的是，本研究中雞源大腸桿菌和腸球菌對多數藥物耐藥程度明顯高于牛和羊場分離的大腸桿菌和腸球菌相應藥物的耐藥程度，提示不同動物來源的細菌對抗菌藥物的耐藥性有所不同。其他相關文獻報道中也有類似的實驗現象。唐標等[16]對雞、鴨、豬源大腸桿菌耐藥性調查結果顯示，雞源大腸桿菌的耐藥率高于鴨和豬源；Ibekwe等[17]對不同動物源產ESBL的大腸桿菌調查，結果發現產ESBL的大腸桿菌在不同動物源中分布廣泛，但豬和奶牛糞便中檢測到的ESBL菌數量明顯高于其他動物；王熙楚等[18]對不同動物來源的腸球菌進行耐藥性分析，研究表明雞源腸球菌耐藥性較其他動物來源更為嚴重。其中，雞源大腸桿菌對四環素和氨芐西林高耐藥率現象與我國不同區域雞源大腸桿菌耐藥表型結果相一致[19]。同時也相似于韓國地區大腸桿菌對四環素和氨芐西林的高耐藥性率[20]。雞源腸球菌對多西環素和紅霉素的高耐藥率現象與我國其他地區腸球菌的高耐藥率也相一致[21-22]。

綜上所述，為了有效地控制細菌耐藥性，持續地針對不同地區不同動物來源的大批量細菌鑒定工作將是常態化技術工作，高效的細菌鑒定技術MALDI-TOF MS可以提高監測效率，值得在動物源細菌耐藥性監測領域推廣應用。與此同時，應該密切關注不同動物源細菌耐藥性不同的現象，利用高效檢測技術，探索不同動物源細菌耐藥性不同的問題原因。