毛細支氣管炎患兒單核細胞TLR4、淋巴細胞CXCR3及血清Mig的表達及臨床意義

付亞妮，湯勉

寶雞市婦幼保健院兒童呼吸科1、兒童重癥科2，陜西 寶雞 721000

毛細支氣管炎是高發于嬰幼兒的一種下呼吸道感染疾病，多為病毒感染引起[1-2]。有研究表明，毛細支氣管炎發展到嚴重階段時可使患兒高頻率喘息，進展為哮喘的概率大大增加[3]。免疫細胞、細胞因子和趨化因子等均參與了毛細支氣管炎的發生發展。趨化因子是近年來臨床研究的熱點，其受體是G蛋白偶聯7次跨膜受體的超家族，其與其受體特異性結合后可發揮相應功能。趨化因子CXCR3是CXC的受體之一，其主要在CD4+T、CD8+T、自然殺傷及樹突等細胞表面存在，屬Th1大類受體，介導一系列炎癥反應[4-6]。CXCR3及其配體血清單核細胞趨化因子(Mig)參與了腫瘤、病毒感染性疾病、自身免疫性疾病、移植排斥反應等的免疫反應，其在免疫調節方面的作用已被臨床研究所證實[7]。眾所周知，毛細支氣管炎與哮喘有著密不可分的聯系，前者發展到一定程度會誘發后者，CXCR3及其Mig與哮喘的發生發展相關[8]，那么其是否在毛細支氣管炎中發揮相似的作用？目前報道較少。Toll樣受體-4(TLR4)主要表達于單核、巨噬細胞表面，能夠識別病原體，有研究稱，毛細支氣管炎患者外周血TLR4水平顯著較正常者增加，提示TLR4參與了毛細支氣管炎的發生過程中[9]。本研究檢測毛細支氣管炎患兒外周血淋巴細胞表面CXCR3的表達率及血清中其配體Mig的濃度水平，研究毛細支氣管炎血單核細胞中TLR4表達與CXCR3及其CXCR3的配體Mig水平變化的相關性，探討毛細支氣管炎可能的發病機制，為臨床診斷和治療毛細支氣管炎提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月至2020年5月在寶雞市婦幼保健院治療的110例毛細支氣管炎患兒作為觀察組，根據呼吸危重評定表(RDAI)評分[10]分為輕中度(RDAI≤8分)患兒65例，重度(RDAI≥9分)患兒45例。納入標準：(1)年齡≤2歲；(2)均為初治患兒；(3)診斷符合《諸福棠實用兒科學》中的標準[11]；(4)患兒監護人知情同意。排除標準：(1)研究前1個月內有免疫制劑藥物服用史；(2)合并有肝腎功能障礙、自身免疫系統疾病、遺傳代謝性疾病等其他嚴重疾病。110例患兒中男性66例，女性44例；年齡3～15個月，平均(11.28±2.01)個月。同時選取在寶雞市婦幼保健院體檢的健康兒童50例作為對照組，其中男性31例，女性19例；年齡3～18個月，平均(10.88±1.891)個月。觀察組和對照組受檢者的一般資料比較差異均無統計學意義(P＜0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 觀察指標與檢測方法 采集所有受試者血樣樣本3 mL。全血樣本用EDTA抗凝管收集，室溫保存，用于TLR4、淋巴細胞CXCR3的檢測。根據紅細胞裂解液(Lysingbuffer，美國BD Pharm Lyse州公司)說明書裂解紅細胞，按照美國BioLe-gend公司生產的單核細胞TLR4、淋巴細胞CXCR3檢測試劑盒說明書孵育抗體，多聚甲醛固定，用流式細胞儀(FACS Calibur，美國BD公司)于48 h內完成檢測。采用ELISA方法檢測血清Mig水平，ELISA試劑盒購自上海森雄科技實業有限公司。繪制標準曲線：先用ST-360型酶標儀(上海科華實驗系統有限公司)檢測標準品在90 pg/mL、60 pg/mL、30 pg/mL、15 pg/mL、7.5 pg/mL、0 pg/mL濃度下的OD值，應用CurveExPert1.3軟件作圖，以濃度為X軸，OD值為Y軸擬合出標準曲線，計算出其回歸方程式。將所測的樣品的OD值代入方程式中，計算得出樣品濃度，乘以稀釋倍數，即得待測樣品濃度。

1.3 統計學方法 應用SPSS22.0統計軟件分析數據。計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，TLR4、CXCR3和血清Mig的相關性采用Pearson相關分析。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組受檢者的TLR4、CXCR3及Mig水平比較 觀察組患兒的TLR4、CXCR3和Mig表達水平明顯高于對照組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 兩組受檢者的TLR4、CXCR3及Mig水平比較(±s)

表1 兩組受檢者的TLR4、CXCR3及Mig水平比較(±s)

組別觀察組對照組t值P值例數110 50 TLR4(ng/mL)24.40±4.11 1.20±0.32 39.792 0.001 CXCR3(ng/mL)15.50±3.22 12.01±1.82 7.154 0.001 Mig(pg/mL)108.28±31.18 65.50±19.22 8.951 0.001

2.2 觀察組不同嚴重程度患兒的TLR4、CXCR3及Mig水平比較 觀察組重度組患兒TLR4、CXCR3和Mig表達水平明顯高于輕中度組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 觀察組不同嚴重程度患兒的TLR4、CXCR3及Mig水平比較(±s)

表2 觀察組不同嚴重程度患兒的TLR4、CXCR3及Mig水平比較(±s)

組別輕中度組重度組t值P值例數65 45 TLR4(ng/mL)23.02±5.58 26.49±6.01-3.107 0.002 CXCR3(ng/mL)14.41±3.10 17.07±5.03-3.429 0.001 Mig(pg/mL)98.89±29.83 121.84±32.20-3.840 0.001

2.3 單核細胞TLR4、淋巴細胞CXCR3及血清Mig的相關性 將TLR4、CXCR3及Mig進行Pearson相關性分析，結果顯示：TLR4與Mig呈正相關(r=0.680，P＜0.05)，CXCR3與Mig呈正相關(r=0.395，P＜0.05)，TLR4與CXCR3呈正相關(r=0.396，P＜0.05)，見圖1。

圖1 相關分析圖

3 討論

毛細支氣管炎發生的主要機制是免疫功能異常，與免疫功能相關的細胞有很多種，其中比較典型的是T淋巴細胞亞群紊亂，即表現為CD4/CD8比值升高[12]。有研究稱，趨化因子及其受體可以激活炎癥細胞，炎癥細胞可遷移至氣道中，引發氣道炎癥[13]。CXCR3與其配體作用后會參與T細胞的激活和遷移，CXCR3本身的表達情況也會受到影響。氣道炎癥及上皮細胞的損傷參與了哮喘的發生發展，目前認為，在哮喘的發病機制中，有CXCR3及其配體的參與。研究發現CXCR3具有減少氣道炎癥和改善氣道反應性的作用，目前關于CXCR3及其受體在毛細支氣管炎患兒中表達特征的研究較少。

本實驗采用流式細胞術檢測CXCR3及Mig的表達特點，結果顯示：觀察組CXCR3和Mig表達明顯高于對照組；觀察組重度患兒CXCR3和Mig表達明顯高于輕中度患兒。提示CXCR3與其配體結合后可加快炎癥細胞向氣道募集和遷移的速度，炎癥區域處又會募集到大量炎癥細胞，加重組織損傷，炎癥因素被認為是毛細支氣管炎的主要發病因素[14]。炎癥反應發生時，Th1細胞大量分泌IFN-γ，其進一步刺激巨噬細胞分泌Mig，Mig濃度顯著增加，Mig水平還可反映Th1細胞的免疫狀態，可對疾病的嚴重程度進行評估。以往的研究表明，RSV感染大鼠肺泡灌洗液中Mig的水平顯著升高，Mig水平升高促進了RSV感染引起的炎癥反應[15]。

在哮喘發病過程中有嗜酸性粒細胞的參與，而毛細支氣管炎與支氣管哮喘發病機制具有一定的同源性。有研究表明，Mig參與了嗜酸細胞活化導致嗜酸性粒細胞向肺內的趨化和聚集過程[15-16]。結合本研究結果，毛細支氣管炎患兒的血清Mig的水平均高于對照組，Mig可能參與了上述過程，促進了毛細支氣管炎的發生與發展。

本研究結果顯示：觀察組TLR4水平明顯高于對照組；觀察組重度患兒TLR4水平明顯高于輕中度患兒。Toll樣受體在固有免疫和獲得性免疫中均扮演了重要角色，可利用其來識別相應的病原體。在一些病毒感染性疾病中均有T LR4的參與，其主要影響機體的免疫反應。研究稱在氣道炎癥疾病中，TLR4水平的升高可加重炎癥反應，加重組織損傷[17]。還可使T細胞大量募集到機體受到免疫攻擊的區域，使此區域變成來了機體T細胞抵抗感染、免疫反應的場所，氣道上皮細胞受損程度加大。TLR4水平與氣道受損程度呈正相關，也與疾病程度呈正相關關系。

本研究經Pearson法分析結果顯示，TLR4水平與Mig、CXCR3水平呈正相關，CXCR3水平與Mig水平呈正相關。Mig具有趨化性，其能與CXCR3特異性結合，使機體發生Ras和ERK級聯反應。在此狀態下，大量炎癥細胞諸如趨化粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞都被大量募集到炎癥部位。再加上在此區域上還有CD8+T細胞和CD4+T細胞等免疫細胞發揮抗感染作用，使此區域的炎癥反應更加嚴重，因此，組織損傷也更加嚴重。體現在氣道炎癥疾病中，可能會導致哮喘及其他一些炎癥疾病。而毛細支氣管炎氣道高反應性主要與炎癥反應、T細胞浸潤和嗜酸性粒細胞聚集激活有關。結合TLR4的變化特點，考慮是毛細支氣管炎患兒T細胞亞群水平紊亂，抑制了機體的免疫功能，導致呼吸道反復感染，伴隨著Mig及CXCR3表達水平的升高，每種因子異常上升都會通過炎癥級聯反應促進其他因子的異常表達，共同促進疾病進展。

Mig和CXCR3不僅有促進T細胞向周圍炎癥部位的遷移的作用，還能使淋巴器官中不同活化淋巴細胞之間的作用不斷增強。Mig和CXCR3結合后產生一系列反應，能夠對機體對病原體的反應性發生變化。Mig具有特定的趨化作用，還能增強炎癥因子釋放及T細胞增殖過程。此外，過敏因素也可能參與了CXCR3致毛細支氣管炎的過程中，因為毛細支氣管炎中有嗜酸性粒細胞參與的機制已被臨床證實[18]。而嗜酸性粒細胞與過敏反應存在密切關聯，所以猜測CXCR3是促進了嗜酸性粒細胞的趨化性來引起了過敏性炎癥。此外，CXCR3也可能誘導肥大細胞脫顆粒，促進肥大細胞在過敏性炎癥中向平滑肌的趨化性。結合本研究結果，推測CXCR3不僅參與毛細支氣管炎的炎癥反應和氣道高反應性的形成，而且過敏因子的存在會影響其在毛細支氣管炎中的表達，這可能導致TLR4的增加。TLR4作用于淋巴細胞上，又會使CXCR3和Mig的表達量增加，三者呈正相關，共同參與毛細支氣管炎的發生發展。

已有研究發現了CXCR3和Mig水平在哮喘和變應性鼻炎中的變化特點[19-20]，但CXCR3和Mig在毛細支氣管炎中是如何影響病程的原因尚未有臨床研究報道。本研究采用對照試驗探索單核細胞TLR4、淋巴細胞CXCR3和血清Mig在毛細支氣管炎中的表達特點及其相互關系具有一定的臨床參考價值。然而，本研究對炎癥機制的研究并不全面，還需要進一步的試驗。

綜上所述，毛細支氣管炎患兒單核細胞TLR4、淋巴細胞CXCR3及血清Mig表達明顯升高，且均與患兒病情程度有關，三者間表達呈正相關關系。