外周血CCL26、CCR3表達(dá)與變應(yīng)性鼻炎患者疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系

熊洪斌，楊茜，石潤杰

1.上海市奉賢區(qū)奉城醫(yī)院耳鼻喉科，上海 201411；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院耳鼻喉科，上海 200011

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)又被稱為變態(tài)反應(yīng)性鼻炎或過敏性鼻炎，是指患者接觸到的過敏物質(zhì)與機(jī)體免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)抗體結(jié)合發(fā)生橋聯(lián)反應(yīng)作用于鼻黏膜從而引起患者發(fā)生血管通透性增加、毛細(xì)血管擴(kuò)張等過敏反應(yīng)[1-2]。AR主要臨床癥狀為連續(xù)性或間歇性打噴嚏、流清水鼻涕、鼻塞、嗅覺暫時(shí)性減退等，雖然不會(huì)危及患者的生命安全，但嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前，關(guān)于AR的診斷主要依賴于臨床癥狀評分，但可能存在患者過度描述臨床癥狀，無法準(zhǔn)確判斷AR，因此，尋找與AR有關(guān)的生物標(biāo)志物成為目前研究的熱點(diǎn)[3-4]。趨化因子配體26(chemokine C-C motif ligand 26，CCL26)又叫嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子3(eosinophil chemotactic factor-3，eotaxin-3)，屬于CC家族重要成員之一。有研究表明，CCL26在炎癥反應(yīng)、過敏反應(yīng)等發(fā)揮重要作用[5]，其與CC趨化因子受體-3(C-C chemokine receptor-3，CCR3)結(jié)合后，特異性激活嗜酸性粒細(xì)胞向炎癥趨化，釋放組織胺等炎性介質(zhì)從而參與炎癥反應(yīng)和過敏性反應(yīng)。CCR3是一種非特異性受體蛋白，除了作為CCL26的受體發(fā)揮作用之外，也可作為嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子1(eosinophil chemotactic factor-1，eotaxin-1)、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子2(eosinophil chemotactic factor-2，eotaxin-2)等其他CC趨化因子的受體來發(fā)揮不同生物學(xué)功能[6]。本研究通過檢測AR患者CCL26、CCR3表達(dá)水平，探討其與AR疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2020年1月在上海市奉賢區(qū)奉城醫(yī)院耳鼻喉科收治的86例AR患者作為研究對象(研究組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《AR診斷和治療指南》中關(guān)于AR的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；②入院前未接受抗組胺、免疫等治療；③知情同意并簽署同意書；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有肝臟、肺腎等重要器官疾病；②合并鼻竇炎、哮喘等過敏性疾病；③合并自身免疫性疾病；④合并精神疾病。86例患者中男性45例，女性41例；年齡24～57歲，平均(34.49±4.71)歲。根據(jù)《變應(yīng)性鼻炎及其對哮喘的影響》中的分類標(biāo)準(zhǔn)[8]將所有AR患者分為輕度AR組(30例)、中度AR組(27例)和重度AR組(29例)。另選取同時(shí)期在我院保健科體檢的91例健康志愿者作為對照組，其中男性46例，女性45例；年齡22～53歲，平均(35.91±4.66)歲。評價(jià)所有受試者的過敏性鼻炎評分量表(Score for Allergic Rhinitis，SFAR)評分。研究組和對照組受檢者的性別和年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。本研究經(jīng)上海市奉賢區(qū)奉城醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 檢測方法

1.2.1 樣本采集 采集所有受試者空腹靜脈血4 mL，以3 000 r/min離心15 min后分離血清，并置于-80℃環(huán)境中保存待測。清晨空腹肘靜脈血置于乙二胺四乙酸抗凝管中，2 000 r/min離心15 min分離出血漿。

1.2.2 檢測外周血CCL26、CCR3表達(dá)水平 采用ELISA法測定各組受試者外周血CCL26的表達(dá)水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，CCL26試劑盒購自上海瓦蘭生物科技有限公司。采用流式細(xì)胞分析儀檢測外周血CCR3相對表達(dá)量，首先加入CCR3-FITC(10 mL)試劑至指標(biāo)試管中，隨后將血漿100 mL加入至試驗(yàn)檢測試管中，設(shè)有同型號對照試管，搖勻后，25℃避光孵育20 min，隨后加入溶血素2 mL，25℃避光放置5 min，離心后(1 000 r/min離心5 min)丟掉上清液，加磷酸鹽緩沖溶液(PBS)2 mL，再一次離心丟掉上清液，添加300 mL PBS溶液，搖勻，采用流式細(xì)胞儀(型號：BD FACSCalibur)上機(jī)檢測分析外周血CCR3在血漿中的表達(dá)。流式細(xì)胞分析儀(型號：BD FACSCalibur)購自美國BD公司。

1.3 觀察指標(biāo) 比較兩組受試者外周血CCL26、CCR3表達(dá)水平、不同臨床參數(shù)AR患者外周血CCL26、CCR3表達(dá)水平以及不同程度AR患者外周血CCL26、CCR3表達(dá)水平；分析AR患者外周血CCL26、CCR3表達(dá)水平與SFAR評分的相關(guān)性；分析CCL26、CCR3對AR的診斷價(jià)值；分析影響AR的危險(xiǎn)因素。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；AR患者外周血CCL26、CCR3表達(dá)水平與SFAR評分的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析法分析；CCL26、CCR3對AR的診斷價(jià)值采用受試者工作特征曲線(ROC)曲線分析；影響AR發(fā)生的危險(xiǎn)因素采用多因素Logistic回歸分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者的外周血的CCL26、CCR3表達(dá)水平比較 與對照組比較，研究組患者外周血CCL26、CCR3表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 兩組受試者的外周血CCL26、CCR3表達(dá)水平比較(±s)

表1 兩組受試者的外周血CCL26、CCR3表達(dá)水平比較(±s)

組別對照組研究組t值P值例數(shù)91 86 CCL26(ng/L)2.44±0.39 4.83±1.07 19.954 0.001 CCR3(%)20.41±5.39 40.63±9.25 17.887 0.001

2.2 不同臨床參數(shù)AR患者外周血CCL26、CCR3表達(dá)水平比較 不同性別、年齡、變應(yīng)原、癥狀發(fā)作時(shí)間的AR患者外周血CCL26、CCR3表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；IgE陽性者外周血CCL26、CCR3表達(dá)水平明顯低于IgE陰性者，SFAR＜7者外周血CCL26、CCR3表達(dá)水平明顯低于SFAR≥7者，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 不同臨床參數(shù)AR患者外周血CCL26、CCR3表達(dá)水平比較(n=86,±s)

表2 不同臨床參數(shù)AR患者外周血CCL26、CCR3表達(dá)水平比較(n=86,±s)

項(xiàng)目性別(例)男女年齡(歲)＜36≥36變應(yīng)原季節(jié)性常年性有無癥狀發(fā)作時(shí)間間接性持續(xù)性IgE陽性陰性SFAR＜7≥7例數(shù)45 41 40 46 51 35 48 38 33 53 55 31 30 56 CCL26(ng/L)3.12±0.99 3.25±1.01 3.33±1.05 3.32±1.02 3.11±0.89 3.51±1.25 4.19±1.86 3.41±1.30 4.02±1.56 4.21±1.64 4.96±1.42 3.87±1.49 3.16±0.87 4.13±1.55 t值0.602 0.045 0.946 1.734 0.087 0.532 0.596 3.358 0.001 3.165 0.002 P值0.549 CCR3(%)41.52±8.31 40.91±9.04 39.69±8.07 40.12±8.81 40.32±8.97 41.01±9.11 41.98±9.64 33.21±8.99 42.35±8.91 42.12±8.77 50.94±9.98 42.56±9.74 35.44±8.78 49.96±9.67 t值0.326 0.235 0.815 0.348 0.729 0.118 0.907 3.771 0.001 6.847 0.001 P值0.745

2.3 不同程度AR患者外周血CCL26、CCR3表達(dá)水平比較 與輕度AR組比較，中度AR組、重度AR組患者外周血CCL26、CCR3表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與中度AR組比較，重度AR組患者外周血CCL26、CCR3表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

表3 不同程度AR患者外周血CCL26、CCR3表達(dá)水平比較(±s)

表3 不同程度AR患者外周血CCL26、CCR3表達(dá)水平比較(±s)

注：與輕度AR組比較，a P＜0.05；與中度AR組比較，b P＜0.05。

組別輕度AR組中度AR組重度AR組F值P值例數(shù)30 27 29 CCL26(ng/L)3.86±0.97 4.99±1.02a 5.69±1.23ab 21.616 0.001 CCR3(%)35.44±8.66 40.21±9.45a 46.38±9.68ab 10.326 0.001

2.4 AR患者外周血CCL26、CCR3表達(dá)水平與SFAR評分的相關(guān)性 經(jīng)Pearson相關(guān)分析法分析結(jié)果顯示，CCL26、CCR3表達(dá)水平與SFAR評分均呈正相關(guān)(r=0.657、0.686，P＜0.01)，見圖1。

圖1 CCL26、CCR3與SFAR評分的相關(guān)性

2.5 CCL26、CCR3對AR發(fā)生的診斷價(jià)值 ROC曲線結(jié)果顯示，外周血CCL26診斷AR發(fā)生的ROC曲線下面積(area under the curve，AUC)為0.697(0.618～0.777)，敏感度為51.2%，特異性為87.9%，截?cái)嘀禐?.914 ng/L；CCR3診斷AR發(fā)生的AUC為0.752(0.678～0.827)，敏感度為62.8%，特異性為84.6%，截?cái)嘀禐?1.197；兩者聯(lián)合檢測的AUC為0.833(0.769～0.897)，敏感度為73.3%，特異性為86.8%，見圖2。

圖2 ROC曲線

2.6 影響AR發(fā)生的危險(xiǎn)因素 將是否患有AR作為因變量(未發(fā)生為0，發(fā)生為1)，以CCL26水平、CCR3表達(dá)水平作為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，外周血CCL26、CCR3表達(dá)水平是影響AR發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P＜0.05)，見表4。

表4 影響AR發(fā)生的多因素Logistic回歸分析

3 討論

AR是耳鼻咽喉頭頸外科常見的非感染性炎性疾病之一。AR嚴(yán)重影響患者的正常生活和工作。世界上約有5億人罹患AR，占全人類的10%～20%[9]。有研究表明，我國19個(gè)一線城市的AR發(fā)病率為4%～38%，且呈上升趨勢[10]。目前AR的診斷主要依賴臨床癥狀評分，然而該方法存在主觀性，AR病情無法得以準(zhǔn)確判斷，因此尋找客觀有效的生物學(xué)指標(biāo)以評估AR病情成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[11-12]。

CCL26由77個(gè)氨基酸組成，能使炎癥細(xì)胞聚集，造成炎癥反應(yīng)和過敏性反應(yīng)。其主要通過與CCR3結(jié)合而發(fā)揮作用，兩者存在一定的協(xié)同作用。CCL26水平升高說明機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)。研究表明，CCL26與遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)有關(guān)，且可作為評估急、慢性炎癥嚴(yán)重程度的生物學(xué)指標(biāo)[13]。劉鈺等[14]研究結(jié)果表明，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)患者血清CCL26水平遠(yuǎn)高于正常人，其表達(dá)水平隨ARDS病情的加重而升高，且ARDS死亡患者血清CCL26水平明顯高于存活患者。肖雷等[15]研究結(jié)果表明，支氣管哮喘急性期患兒血清CCL26水平明顯高于哮喘緩解期患兒，且其水平隨哮喘病情的加重而升高。本研究中，與對照組比較，研究組AR患者外周血CCL26水平明顯升高，隨AR病情的加重而升高。且Pearson相關(guān)分析法分析顯示AR患者外周血CCL26水平與SFAR評分呈正相關(guān)，與前述研究結(jié)果相近，提示CCL26的表達(dá)在AR的發(fā)生發(fā)展中起到一定作用，且CCL26可反映AR病情嚴(yán)重程度。此外，本研究中多因素Logistic回歸分析表明，CCL26是AR發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示CCL26可作為診斷AR發(fā)生的輔助指標(biāo)。

CCR3是一種含7次跨膜結(jié)構(gòu)的G蛋白耦聯(lián)非特異性受體，是CC型趨化因子的唯一受體。eotaxin-1、eotaxin-2、CCL26、單核細(xì)胞趨化因子、CCL5等均通過與CCR3結(jié)合后發(fā)揮作用。研究表明，eotaxins幾乎都是通過CCR3介導(dǎo)而發(fā)揮對嗜酸性粒細(xì)胞的趨化作用，且CCR3還能夠激活Th2細(xì)胞亞群，使其大量釋放炎性因子從而發(fā)生炎癥反應(yīng)[16]。楊艷等[17]研究結(jié)果表明，慢性自發(fā)性蕁麻疹患者CCR3表達(dá)水平明顯高于健康者。DE CAMPOS等[18]研究顯示持續(xù)性變應(yīng)性鼻炎患者鼻黏膜中CCR3表達(dá)水平上調(diào)。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，研究組AR患者外周血CCR3表達(dá)水平明顯升高，其水平隨AR病情的加重而升高。經(jīng)Pearson相關(guān)分析法分析結(jié)果顯示AR患者外周血CCR3表達(dá)水平與SFAR評分呈正相關(guān)，與前述研究結(jié)果相近，提示CCR3表達(dá)水平與AR發(fā)生發(fā)展有關(guān)。CCR3可反映AR病情嚴(yán)重程度，推測可能是CCR3介導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞聚集，而后激活的嗜酸性粒細(xì)胞通過釋放炎性介質(zhì)參與炎癥性疾病的發(fā)生。多因素Logistic回歸分析表明，CCL26是AR發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示CCR3可輔助診斷AR的發(fā)生。

此外，經(jīng)ROC曲線分析結(jié)果顯示，CCL26診斷AR患者的AUC為0.697，取最佳診斷界值2.914 ng/L時(shí)，相應(yīng)的敏感度為51.2%，特異性為87.9%；CCR3診斷AR患者的AUC為0.752，取最佳診斷界值31.197時(shí)，相應(yīng)的敏感度為62.8%，特異性為84.6%；兩者聯(lián)合檢測的AUC為0.833，敏感度為73.3%，特異性為86.8%。這說明CCL26、CCR3表達(dá)水平檢測對AR的診斷具有一定價(jià)值，但兩種方法聯(lián)合檢測優(yōu)于單獨(dú)一種方法檢測。

綜上所述，CCL26、CCR3的表達(dá)水平與AR的發(fā)生有關(guān)，且其可判斷AR病情的嚴(yán)重程度，并為AR患者的診斷提供理論依據(jù)。