二甲雙胍對老齡大鼠腦缺血再灌注損傷腦水腫的影響

王成 馬景鑑 (天津市津南醫院腦系科，天津 300350；天津市第一中心醫院神經外科)

缺血性腦卒中占所有腦卒中的80%以上，且以致殘率高及致死率高為特點，嚴重威脅著人類的健康和生活質量，其中近75%的腦卒中患者為年齡大于65歲的老年人，因為缺乏有效的治療策略，直到現在缺血性腦卒中的治療仍然是一項艱巨的任務〔1，2〕。缺血性腦卒中介入或溶栓治療血管再通后，由腦缺血再灌注損傷(CIR)所致的繼發神經損傷在臨床治療中十分常見，這些事件包括炎癥、血腦屏障(BBB)破裂、腦水腫、壞死及凋亡〔3，4〕。二甲雙胍是一種雙胍，廣泛用于2型糖尿病與代謝綜合征的治療，研究表明二甲雙胍具有多種藥理活性，比如抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗腫瘤，且能夠通過BBB，在多領域具有重要的應用價值〔5，6〕。本研究旨在探討二甲雙胍對老年CIR大鼠腦水腫的影響及機制，驗證其對CIR老年大鼠的神經功能保護作用，為老年患者CIR的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1動物及材料 SPF級健康老年SD大鼠(天津實驗動物中心提供)60只，18～20月齡，雌雄不限，體重490～680 g，動物批號：SYXK(津)2019-0004。二甲雙胍(Sigma，USA，貨號D150959-5G)；基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、水通道蛋白(AQP)9、β-actin單克隆抗體(sigma公司，美國)、Trizol試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG、Western印跡試劑盒(碧云天生物技術研究所)；引物合成(上海生工)；普通光學倒置顯微鏡(Nikon)；過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；激光多普勒血流測定探頭(瑞典perimed)。

1.2方法

1.2.1大鼠CIR模型制作及分組 60只SD老年大鼠，室溫25℃左右飼養，術前12 h禁食，自由飲水，隨機分為3組：假手術組(n=20)、缺血/再灌注(I/R)組(n=20)、二甲雙胍組(n=20)。CIR模型制作按參考文獻進行〔7〕，假手術組只進行手術操作，但不插入線栓阻斷大腦中動脈血流；I/R組：通過直徑 0.28～0.32 mm的線栓阻斷大鼠大腦中動脈血流，造成大鼠局灶性腦缺血，缺血2 h后拔出線栓恢復血流再灌注，給予等量的0.9%生理鹽水腹腔注射；二甲雙胍組：大鼠CIR制模成功后，予二甲雙胍(50 mg/kg)腹腔注射，1次/d，連續7 d。造?；蛑委熯^程中有大鼠死亡或脫失重新造模后補上。

1.2.2腦血流量的測定及神經功能缺損評分 治療7 d，各組隨機選5只大鼠(不處死，可進行后繼檢測)，將激光多普勒血流測定探頭通過泰樂膠固定在頂部百會穴(兩耳尖連線中點)，測定老年大鼠局灶性腦缺血區血流量，因Perimed 激光多普勒血流測定儀的顯示結果為電壓值，該電壓值與腦血流量呈正比，故本實驗直接將電壓值行統計學分析，作為老年大鼠腦血流量相對值，待儀表穩定1 min后對數值進行記錄，參考文獻〔8〕行神經功能缺損評分，操作過程由專業人員統一完成。

1.2.3腦組織含水百分比測定 治療7 d，各組隨機選5只大鼠，斷頭法處死后取腦組織置于稱過重的鋁箔上測定重量，腦組織濕重為測得重量與鋁箔重量的差值，將外包鋁箔的腦組織置于恒溫烤箱內(溫度90℃，時間24 h)烘干，烘干后取出，待其自然降溫到室溫后再次進行測重，測得重量與鋁箔重量的差值為腦組織干重，腦組織含水百分比=(1-腦干重/腦濕重)×100%。

1.2.4腦組織蘇木素-伊紅(HE)染色 治療7 d，各組隨機選5只大鼠，4%的多聚甲醛經心灌流固定后，迅速斷頭取腦，將腦組織石蠟包埋后，矢狀連續切片，片厚5 μm，石蠟切片按常規用二甲苯脫蠟，經各級乙醇脫水，二甲苯透明處理后，蘇木素染色3 min，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化10 s后伊紅染色3 min，自來水沖洗，中性樹脂封固后，光鏡觀察腦組織病理學變化。

1.2.5腦組織NO、SOD、MDA、CAT、GSH-Px檢測 治療7 d，各組隨機選5只大鼠，斷頭法處死后取腦組織，稱重后按(1∶9)加入4℃的生理鹽水后制備腦組織勻漿，于3 000 r/min離心15 min，取上清液，-20℃保存。按相關試劑盒說明操作步驟測定腦組織中SOD、CAT、GSH-Px活性及NO、MDA水平。

1.2.6RT-PCR 檢測MMP-2、MMP-9、AQP9基因表達 治療7 d，各組剩余5只大鼠，斷頭法處死后取腦組織，取50 mg腦組織，按Trizol說明書行總RNA提取，按逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄為cDNA，然后再將cDNA行PCR擴增。MMP-2 引物：上游：5′-TTTTTGTGCCCAAAGAAAGG-3′，下游：5′-ATGTCAGACAACCCGAGTCC-3′，產物長度為414 bp；MMP-9引物：上游：5′-CCAGCTGTGATTCCAAAACGGAC-3′，下游：5′-TGCAAGGATTGTCATCTGGA-3′，產物長度為379 bp；AQP9 引物：上游：5′-CCAGCTGTGATTCCAAAACGGAC-3′，下游：5′-TCTAGTCATACTGAAGACAATACCTC-3′，產物長度為305 bp；β-actin 引物：上游：5′-CCATCATGAAGTGTGACGTTG-3′，下游：5′-ACAGAGTACTTGCGCTCAGGA-3′，產物長度為175 bp，反應條件如下：95℃預變性1 min，95℃變性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環，將擴增產物電泳，通過凝膠圖像處理系統分析光密度，計算MMP-2、MMP-9、AQP9與β-actin的光密度比值，作為MMP-2、MMP-9、AQP9表達指標。

1.2.7Western印跡檢測MMP-2、MMP-9、AQP9蛋白表達 將RT-PCR提取剩余物以 1 500 r/min離心30 min，取上清粗體蛋白，用BCA法行蛋白定量，-80℃冰箱保存。50 μg樣品蛋白，配置12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離膠，蛋白上樣后電泳分離，90 V轉膜60 min，恒流濕轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，將目的條帶切下后，通過磷酸鹽緩沖液(PBS)配制的5% BSA封閉2 h，然后加入相應MMP-2、MMP-9、AQP9與β-actin兔抗鼠一抗(1∶1 500)4℃孵育過夜；PBS洗膜后，加入二抗HRP標記的羊抗兔IgG(稀釋度為1∶5 000)37℃孵育2 h，PBS洗膜，電化學發光(ECL)顯色，曝光后掃描，Image Pro-plus軟件 行灰度值統計分析，算MMP-2、MMP-9、AQP9與GAPDH的灰度比值，作為MMP-2、MMP-9、AQP9 蛋白的表達指標。

1.3統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行統計分析，數據經K-S檢驗符合正態分布，多組間的比較予以方差分析，組間比較應用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1腦血流量及腦組織含水百分比 與假手術組相比，I/R組腦組織含水百分數顯著升高，腦血流量顯著降低(P<0.05)，神經功能缺損評分顯著升高(P<0.05)；二甲雙胍組較I/R組腦組織含水百分數顯著降低，腦血流量顯著升高(P<0.05)，神經功能缺損評分顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組腦血流量、腦組織含水百分比及 神經功能評分比較

2.2各組腦組織病理變化 假手術組腦組織細胞層次分明，胞核圓形，未見腦水腫。I/R組神經細胞腫脹松散，腦水腫明顯，層次紊亂，結構欠清。二甲雙胍組神經細胞腫脹松散程度及腦水腫程度較I/R組減輕，見圖1。

2.3各組腦組織 NO、MDA水平及SOD、CAT、GSH-Px活性比較 與假手術組比較，I/R組腦組織NO、MDA含量顯著升高(P<0.05)，腦組織SOD、CAT、GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)；與I/R組相比，二甲雙胍組NO、MDA含量顯著降低(P<0.05)，腦組織SOD、CAT、GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)。見表2。

圖1 各組I/R腦組織病理變化(HE染色，×100)

表2 各組腦勻漿中NO、SOD、MDA、CAT、GSH-Px水平比較

2.4MMP-2、MMP-9、AQP9 mRNA表達水平 與假手術組相比，I/R組腦組織MMP-2、MMP-9、AQP9 mRNA表達明顯升高(P<0.05)，二甲雙胍組腦組織MMP-2、MMP-9、AQP9 mRNA表達較I/R組顯著降低(P<0.05)，見圖2，表3。

圖2 各組MMP-2、MMP-9、AQP9 mRNA表達

表3 各組腦組織MMP-2、MMP-9、AQP9 mRNA 表達

2.5MMP-2、MMP-9、AQP9 蛋白表達水平 與假手術組相比，I/R組腦組織MMP-2、MMP-9、AQP9蛋白表達明顯升高(P<0.05)，二甲雙胍組腦組織MMP-2、MMP-9、AQP9蛋白表達較I/R組降低，差異顯著(P<0.05)，見表4，圖3。

表4 各組腦組織MMP-2、MMP-9、 AQP9 蛋白 表達

3 討 論

目前傳統的治療方法仍未能有效實現I/R后神經細胞的再生及神經功能的有效修復〔9〕。二甲雙胍對多種中樞神經系統疾病的動物模型有神經保護作用，通過調節炎癥反應、神經元凋亡、氧化應激等對脊髓損傷或CIR動物模型發揮神經保護作用〔10～13〕。

本研究組織學方面發現二甲雙胍減輕了CIR老年大鼠腦水腫病理變化，對CIR老年大鼠腦組織損傷有改善作用，有效提高CIR老年大鼠腦組織血流量，改善腦組織血供，減輕大鼠腦組織水腫，使得腦組織含水百分比降低，發揮腦保護作用。

本研究結果表明氧化應激反應是導致CIR老年大鼠腦損傷和腦水腫的重要因素，二甲雙胍干預能夠降低CIR老年大鼠腦組織的自由基，提高腦組織的抗氧化作用，進而減輕了CIR老年大鼠腦水腫，發揮對腦組織的保護作用。MMP-2、MMP-9及AQP9的高表達是腦組織水腫及繼發損傷過程中的重要因素，本研究結果表明二甲雙胍治療通過調控MMP-2、MMP-9、AQP9基因蛋白表達減輕組織水腫發揮腦保護作用。

綜上，二甲雙胍治療可明顯減輕CIR老年大鼠腦損傷和腦水腫，提高I/R腦組織局部的血流量，降低神經功能缺損評分，為二甲雙胍在老年缺血性腦卒中的應用提供了理論依據。