基于Wnt/β-catenin信號通路探究小金丹對直腸癌細胞增殖、遷移和EMT的影響

謝興旺 柯超 周紅見 裴勝利 (武漢市第三醫院胃腸外科，湖北 武漢 430060)

直腸癌是常見癌癥，其發病率和死亡率極高，直腸癌細胞凋亡減少、遷移、侵襲能力增加是直腸癌快速進展的重要原因〔1〕。小金丹出自《外科證治全生集》，具有消腫、解毒、化痰、活血等功效，由地龍、木鱉子、五靈脂等組成，現階段臨床上用于甲狀腺瘤、膿腫、慢性肝炎、聚合性痤瘡等治療〔2〕。有研究〔3,4〕顯示，小金丹有抗腫瘤作用，對肝癌、乳腺癌等有抑制作用。目前尚不清楚小金丹對直腸癌細胞遷移等的作用和機制。Wnt信號是目前研究較多的信號轉導通路，Wnt/β-連環蛋白(catenin)是經典的Wnt信號通路，參與糖尿病、腫瘤、腦卒中等疾病進展〔5〕。在腫瘤中已經發現Wnt/β-catenin過度激活，抑制Wnt/β-catenin可阻礙腫瘤生長和轉移〔6〕。本實驗基于Wnt/β-catenin信號研究小金丹對直腸癌細胞遷移、侵襲、凋亡、上皮間質轉化(EMT)等的影響。

1 材料與方法

1.1材料 直腸癌細胞HR-8348，上海博麥德生物技術有限公司提供。小金丹提取物由西安高遠生物科技有限公司提供。小金丹配方：50 g五靈脂、50 g楓香脂、50 g地龍、25 g醋沒藥、50 g制草烏、25 g醋乳香、25 g酒當歸、4 g墨炭、50 g木鱉子，研磨成粉狀，然后將人工麝香研磨，混合，添加4℃預冷后的乙醇(70%)浸泡，超聲提取，4℃冷浸，提取上清液，過濾(0.22 μm)，用培養基稀釋成實驗需要的濃度。主要試劑：兔抗B細胞淋巴瘤(Bcl)-2相關X蛋白(Bax)抗體、兔抗β-catenin抗體，武漢菲恩生物科技有限公司產品；兔抗c-myc抗體，美國Santa Cruz Biotechnology公司產品；兔抗基質金屬蛋白酶(MMP)-9抗體，南京歐凱生物科技有限公司產品；兔抗細胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體，美國Cell Signaling Technology公司產品；兔抗細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)2抗體，美國GeneTex公司產品；兔抗上皮性鈣黏附素(E-cadherin)抗體，北京義翹神州科技股份有限公司產品；兔抗神經性鈣黏附素(N-cadherin)抗體，江蘇親科生物研究中心有限公司產品；兔抗Bcl-2抗體，青島捷世康生物科技有限公司產品；Wnt/β-catenin通路激活劑LiCl，北京索萊寶科技有限公司產品。

1.2實驗分組 直腸癌細胞培養條件為：37℃，飽和濕度，5% CO2培養箱，細胞置于含有10%胎牛血清的DMEM中培養。細胞培養至對數期時，將細胞分成對照組、低劑量組、中劑量組、實驗高劑量組(在實驗開始時分別給予0、20、40、80 mg/L小金丹處理)、高劑量+LiCl組(在實驗開始時給予80 mg/L小金丹和20 mmol/L〔7〕LiCl處理)。

1.3噻唑藍(MTT)檢測增殖活性 直腸癌細胞種植到96孔板內，分別在細胞中添加0、5、10、20、40、80、160 mg/L小金丹，細胞培養24 h后，在每個孔內添加MTT工作液10 μl，繼續培養4 h。將孔中的上清溶液棄掉，添加150 μl二甲基亞砜，10 min后，上酶標儀測定各孔光密度(OD)值，以OD值表示細胞增殖活性。

1.4Western印跡檢測β-catenin、c-myc、CyclinD1、CDK2、E-cadherin、N-cadherin、MMP-9、Bax、Bcl-2蛋白表達 直腸癌細胞種植到6孔板內，每個孔內添加106個細胞，按照1.2中方法分組處理細胞，培養24 h后，添加含有1%苯甲基磺酰氟化物(PMSF)的放射免疫沉淀試驗(RIPA)溶液，放在冰上反應30 min。刮取細胞，11 000 r/min離心5 min。吸取上清，放在-80℃保存。利用二喹啉甲酸(BCA)方法檢測蛋白濃度。在蛋白提取物中添加5倍上樣緩沖液，100℃煮沸5 min。每個孔內添加60 μg蛋白(20 μl體積)。配制12%分離膠、5%積層膠，在積層膠中用80 V電壓電泳，在分離膠中用120 V電壓電泳，觀察溴酚藍染料進入凝膠的最下端，取出凝膠。裁剪聚偏氟乙烯(PVDF)膜，90 V電壓轉膜90 min。將PVDF膜放在5%牛血清白蛋白溶液中，在室溫中結合1 h。然后將PVDF膜放在一抗內，4℃搖床孵育過夜。PVDF膜放在二抗內，在室溫搖床孵育1 h。ECL發光。以GAPDH作為內參，掃描條帶的灰度值，根據灰度值分析目的蛋白表達量。β-catenin、N-cadherin、c-myc、CDK2抗體稀釋倍數為1∶1 200，E-cadherin、MMP-9抗體稀釋倍數為1∶800，Bax、CyclinD1、Bcl-2抗體稀釋倍數為1∶1 000，二抗稀釋倍數為1∶4 000。

1.5PI單染法檢測周期 直腸癌細胞種植到6孔板內，每個孔內添加106個細胞，按照1.2中方法分組處理細胞，培養24 h后，收集細胞，用預冷的70%乙醇固定，800 r/min離心5 min。吸棄上清。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次。添加碘化丙啶(PI)染色液，在37℃孵育30 min。用流式細胞儀檢測周期。

1.6膜聯蛋白(Annexin)V-FITC/PI雙染法檢測凋亡 直腸癌細胞種植到6孔板內，每個孔內添加106個細胞，按照1.2中方法分組處理細胞，培養24 h后，收集細胞，以1倍結合緩沖液重懸細胞，細胞濃度為1×106個細胞/ml，吸取100 μl細胞懸浮液，添加5 μl Annexin V-FITC、100 μg/ml PI溶液，在室溫中避光孵育15 min。繼續添加400 μl 1倍結合緩沖液，混合后，放在冰上備用。上流式細胞儀檢測凋亡變化。

1.7Transwell小室檢測遷移和侵襲 在細胞侵襲實驗前，首先用Matrigel將小室包被。其余操作相同。將直腸癌細胞按照1.2中方法分組處理，懸浮在不含血清的細胞培養液中。在小室的上室內添加1×105個細胞(200 μl細胞培養液)，在下室中添加600 μl含10%胎牛血清的DMEM細胞培養液。繼續培養24 h。將小室內的液體吸棄，用棉簽擦掉沒有穿膜的細胞，90%乙醇固定，0.1%的結晶紫染色，在顯微鏡下觀察細胞穿膜數目，即為細胞遷移/侵襲數目。

1.8統計學分析 采用SPSS25.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組直腸癌細胞增殖活性比較 與0 mg/L(0.79±0.08)比較，20、40、80、160 mg/L小金丹處理后的直腸癌細胞增殖活性(0.66±0.04、0.55±0.03、0.43±0.04、0.32±0.02)顯著降低(P<0.05)；5、10 mg/L(0.76±0.08、0.74±0.08)無變化。160 mg/L小金丹處理后的直腸癌細胞存活率低于50%，選擇20、40、80 mg/L小金丹進行后續實驗。

2.2各組β-catenin、c-myc蛋白表達比較 與對照組比較，低、中、高劑量組β-catenin、c-myc蛋白表達量逐漸降低；與高劑量組比較，高劑量+LiCl組升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1和表1。

1～5:對照組，低劑量組，中劑量組，高劑量組，高劑量+LiCl組；圖2、4、7同圖1 Western印跡檢測小金丹處理后直腸癌 細胞中Wnt/β-catenin信號相關蛋白表達

表1 各組β-catenin、c-myc蛋白表達量比較

2.3小金丹調控Wnt/β-catenin信號抑制直腸癌細胞增殖和周期進展 與對照組比較，低、中、高劑量組細胞增殖活性降低，G0/G1期比例逐漸升高，Cyc-linD1、CDK2蛋白表達量逐漸降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與高劑量組比較，高劑量+LiCl組細胞增殖活性升高，G0/G1期比例降低，CyclinD1、CDK2蛋白表達量升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2、圖3和表2。

圖2 Western印跡檢測小金丹處理后的 直腸癌細胞中CyclinD1、CDK2蛋白表達

圖3 PI單染法檢測細胞周期

表2 各組直腸癌細胞增殖活性、細胞周期分布和CyclinD1、CDK2蛋白表達量比較

2.4小金丹調控Wnt/β-catenin信號抑制直腸癌細胞遷移、侵襲和EMT 與對照組比較，低、中、高劑量組細胞遷移數目、侵襲數目和N-cadherin、MMP-9蛋白表達量逐漸降低，E-cadherin蛋白表達量逐漸升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與高劑量組比較，高劑量+LiCl組細胞遷移數目、侵襲數目和N-cadherin、MMP-9蛋白表達量顯著升高，E-cadherin蛋白表達量顯著降低(P<0.05)。見圖4、圖5和表3。

2.5小金丹調控Wnt/β-catenin信號對直腸癌細胞凋亡的影響 與對照組比較，低、中、高劑量組細胞凋亡率和Bax蛋白表達量逐漸升高，Bcl-2蛋白表達量逐漸降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與高劑量組比較，高劑量+LiCl組細胞凋亡率和Bax蛋白表達量顯著降低，Bcl-2蛋白表達量顯著升高(P<0.05)。見圖6、圖7和表4。

圖4 Western印跡檢測小金丹處理后的直腸癌細胞中 E-cadherin、N-cadherin、MMP-9蛋白表達

圖5 Transwell小室檢測直腸癌細胞遷移和侵襲(×200)

表3 各組細胞遷移數目、侵襲數目和E-cadherin、N-cadherin、MMP-9蛋白表達量比較

圖6 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測小金丹處理后的直腸癌細胞凋亡

圖7 Western印跡檢測小金丹處理后的 直腸癌細胞中Bax、Bcl-2蛋白表達

表4 各組細胞凋亡率和Bax、Bcl-2蛋白 表達量比較

3 討 論

小金丹，原書上記載其可以用于治療乳癖、流柱、乳巖等疾病，現代藥理學研究發現其對腫瘤也有治療作用〔2〕。有實驗〔3,4〕顯示，小金丹可降低乳腺癌、肝癌細胞增殖、遷移能力。本研究結果提示小金丹具有抗直腸癌細胞惡性生物學行為的作用，這為小金丹治療直腸癌的臨床應用提供了理論支撐。

腫瘤細胞惡性生物學行為與細胞內多種調控因子有關，細胞周期是細胞增殖的基礎，其可以分成分裂期和分裂間期，其中細胞從G0/G1期向S期進展是細胞周期調控的關鍵點〔8〕。CyclinD1、CDK2是細胞周期的促進因子，可促進細胞從G0/G1期向S期轉變，進而加快細胞增殖〔9〕。與細胞凋亡有關的調控因子有很多，其中包括Bcl-2蛋白家族，Bax是Bcl-2蛋白家族中的促凋亡因子，Bcl-2是Bax蛋白家族中的抗凋亡蛋白，二者表達變化與細胞凋亡改變有關〔10,11〕。MMP-9屬于MMPs家族成員，在細胞運動、遷移中發揮促進作用，其能夠將細胞外基質降解，進而為細胞遷移提供條件〔12〕。EMT是腫瘤轉移的早期標志性事件，是指上皮細胞特征逐漸消失而間質細胞特征逐漸明顯的過程，E-cadherin是上皮細胞標志蛋白，N-cadherin是間質細胞標志蛋白〔13,14〕。本實驗進一步說明小金丹有抗直腸癌細胞轉移潛能和促進細胞凋亡的作用。

β-catenin是Wnt經典信號通路Wnt/β-catenin的核心蛋白，c-myc是Wnt/β-catenin信號的下游靶基因〔15～17〕。本實驗發現，小金丹能夠降低直腸癌細胞中β-catenin、c-myc蛋白表達量，小金丹可能通過影響Wnt/β-catenin信號抑制直腸癌細胞生長和轉移。Wnt/β-catenin信號在腫瘤中過度表達，而抑制Wnt/β-catenin信號能夠抑制腫瘤進展和轉移〔18～20〕。本實驗結果提示小金丹通過下調Wnt/β-catenin信號激活水平發揮抗直腸癌細胞惡性生物學行為的作用，這為研究小金丹抗直腸癌分子機制奠定了基礎。