miR-139-5p靶向SLC39A7基因通過Wnt/β-catenin信號抑制腎癌細胞周期和增殖

石濤 高艷 凡磊 周本正 丁志勇 張大虎

(湖北醫藥學院附屬襄陽醫院 (襄陽市第一人民醫院) 1泌尿外科，湖北 襄陽 441000；2綜合內科)

腎癌(RC)是常見的泌尿系統惡性腫瘤，占成人惡性腫瘤的2%～3%，Ⅲ期RC患者5年平均生存率為53%，轉移性RC患者5年平均生存率為8%〔1〕。腎切除術是局部腎癌的重要干預措施，但對于術后復發或有轉移的患者主要采用個性化靶向治療〔2〕。

研究表明，Micro RNA(miRNA)參與RC的轉移和進展，并與患者早期轉移的侵襲性腫瘤特征相關，可能是患者預后和疾病進展的標志物〔3〕。腎透明細胞癌中，miR-139-5p低表達，并與患者高復發風險相關〔4〕。本研究通過StarBase預測發現，miR-139-5p與SLC39A7可能存在靶向關系。SLC39A7在前列腺癌細胞中高表達，miR-15a-3p下調SLC39A7通過Wnt/β-catenin信號通路抑制癌細胞的增殖和侵襲〔5〕。在宮頸癌〔6〕和結腸癌〔7〕中敲減SLC39A7可抑制癌細胞增殖、遷移、侵襲或誘導細胞凋亡。SLC39A7在RC中表達和作用尚不清楚。根據預測結果和上述研究結果，本研究以RC細胞系為主要研究對象，假設miR-139-5p靶向SLC39A7基因通過Wnt/β-catenin信號通路調節RC細胞周期和增殖，并對其進行驗證。以期為RC的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1材料 人正常腎小管上皮細胞HK-2及RC細胞系A498、786-O和SN12C-PM6購自美國ATCC；RPMI1640培養基、DMEM高糖培養基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自Sigma-Aldrich公司；細胞培養板購自美國Corning公司；CCK-8試劑盒和細胞周期檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；引物、miR-139-5p模擬物(miR-139-5p)、miR-139-5p抑制劑(anti-miR-139-5p)、SLC39A7過表達載體(pcDNA-SLC39A7)、SLC39A7抑制劑(si-SLC39A7)和對照(miR-con、anti-miR-con、si-con和pcDNA-con)及SLC39A7野生型和突變型雙熒光載體購自上海吉瑪制藥有限公司；SLC39A7抗體、細胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體、CyclinE抗體、β-catenin抗體和β-actin抗體購自美國Abcam；雙熒光素酶報告系統購自美國Promega公司；Lipofectamine 2000轉染試劑、總RNA提取試劑盒、實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒、反轉錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；流式細胞儀購自美國BD公司；光學顯微鏡、全自動酶標儀、發光儀和qRT-PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 在DMEM高糖培養液中培養人正常腎小管上皮細胞HK-2，在RPMI1640培養液中分別培養RC細胞A498、786-O和SN12C-PM6，培養液中均含10%FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素，培養條件：在濕度95%，37℃ 5%CO2培養箱中培養細胞，消化傳代。

1.2.2細胞轉染 將786-O細胞培養至對數生長期，收集細胞，胰蛋白酶消化，以1×106個/ml接種于6孔板培養，當細胞融合度達到90%時根據Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行轉染。轉染分組：miR-139-5p高表達組(轉染miR-con和miR-139-5p)；SLC39A7敲減組(轉染si-con和si-SLC39A7)；miR-139-5p抑制組(轉染anti-miR-con和anti-miR-139-5p)；miR-139-5p和SLC39A7高表達組(轉染miR-139-5p+pcDNA-con和miR-139-5p+pcDNA-SLC39A7)；SLC39A7突變型(MUT，轉染miR-con+MUT、miR-139-5p+MUT)和野生型(WT，轉染miR-con+WT、miR-139-5p+WT)雙熒光素酶報告載體組。將載體轉染培養好的786-O細胞，轉染48 h，收集細胞，驗證轉染，進行后續實驗。

1.2.3qRT-PCR檢測RNA的表達 用Trizol試劑從HK-2、A498、786-O和SN12C-PM6細胞中提取總RNA，然后反轉錄合成cDNA并檢測，然后以cDNA 為模板，按照qRT-PCR試劑盒說明書進行反應，合成miR-139-5p和SLC39A7 mRNA，反應程序為：95℃ 1 min；95℃ 30 s、59℃ 40 s、72℃ 45 s，40個循環；72℃ 5 min。運用2-ΔΔCt法進行數據分析。

1.2.4CCK-8實驗測定細胞存活率 將轉染后的786-O培養至對數生長期，胰蛋白酶消化細胞，培養基重懸并稀釋細胞，以濃度2×103個細胞/孔(200 μl細胞)接種于96孔板，NC組加入未轉染的786-O細胞，加入20 μl CCK-8溶液，培養4 h，酶標儀檢測450 nm處的吸光度(A)值。細胞存活率=實驗組A值/對照組A值×100%。

1.2.5流式細胞術檢測細胞周期 將轉染后的786-O培養至對數生長期，用胰蛋白消化細胞，收集細胞，清洗細胞，用70%冷乙醇固定細胞4℃過夜，離心收集細胞，加入500 μl配制好的碘化丙啶(PI)染色液，37℃避光孵育30 min，然后上流式細胞儀488 nm波長處檢測紅色熒光，計算各組G0/G1期、S期、G2/M期細胞百分比。

1.2.6Western印跡 收集各組轉染的786-O細胞，室溫用放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液裂解細胞30 min，超聲破碎細胞，收集蛋白，檢測蛋白濃度。將蛋白樣本進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉聚偏氟乙烯(PVDF)膜，脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入一抗，SLC39A7抗體(1∶1 000)、CyclinD1抗體(1∶3 000)、CyclinE抗體(1∶1 500)、β-catenin抗體(1∶6 000)和抗β-actin抗體(1∶2 000)，4℃孵育過夜。洗膜3次，然后加入稀釋的辣根過氧化物酶標二抗，室溫孵育2 h。以β-actin為內參照，分析蛋白水平。

1.2.7雙熒光素酶報告系統實驗 根據1.2.2方法培養786-O至細胞融和度為90%，進行轉染，將構建SLC39A7的WT和MUT雙熒光素酶報告載體，分別與miR-con或miR-139-5p共轉染786-O細胞，轉染48 h，收集細胞，裂解細胞，離心收集上清，-20℃保存或直接檢測熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內參，計算相對螢火蟲熒光素酶活性。

1.3統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1RC細胞系SLC39A7和miR-139-5p水平 與正常腎小管上皮細胞HK-2組相比，RC細胞系A498、786-O和SN12C-PM6組細胞中SLC39A7的mRNA和蛋白表達量均顯著上升(P<0.05)，miR-139-5p表達量均顯著下降(P<0.05)，見圖1和表1。SLC39A7和miR-139-5p在A498、786-O和SN12C-PM6腎癌細胞系中表達情況一致，采用786-O進行后續實驗。

圖1 Western印跡檢測SLC39A7表達

表1 RC細胞系miR-139-5p和SLC39A7 水平

2.2高表達miR-139-5p抑制RC細胞786-O細胞周期和增殖 與NC組和miR-con組相比，miR-139-5p組miR-139-5p表達量顯著上升(P<0.05)，細胞存活率顯著降低(P<0.05)，CyclinD1和CyclinE表達量均顯著降低(P<0.05)，G0/G1期和G2/M期細胞百分比顯著升高(P<0.05)，S期細胞百分比顯著降低(P<0.05)，見圖2和表2。說明過表達miR-139-5p可降低RC 786-O細胞的存活率，抑制細胞周期。

圖2 Western印跡檢測CyclinD1和CyclinE蛋白

表2 高表達miR-139-5p抑制RC細胞786-O細胞周期和增殖

2.3敲減SLC39A7抑制RC細胞786-O細胞周期和增殖 與NC組和si-con組相比，si-SLC39A7組786-O細胞中SLC39A7、CyclinD1和CyclinE表達量顯著下降(P<0.05)，細胞存活率顯著降低(P<0.05)，G0/G1期和G2/M期細胞百分比顯著升高(P<0.05)，S期細胞百分比顯著降低(P<0.05)，見表3和圖3。說明敲減SLC39A7表達可抑制RC 786-O細胞周期和增殖。

2.4miR-139-5p靶向調控SLC39A7的表達 StarBase預測結果顯示，SLC39A7的3′UTR序列中含有與miR-139-5p互補的核苷酸序列。見圖4A。構建含有miR-139-5p結合位點的SLC39A7-3′UTR WT及MUT報告基因載體，在786-O細胞中轉染miR-139-5p mimics和SLC39A7 WT及MUT報告基因載體，結果如表4所示，與miR-con組相比，miR-139-5p組WT-SLC39A7的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著下降(P<0.05)；而MUT-SLC39A7的熒光素酶相對活性無明顯變化(P>0.05)。Western印跡結果發現，與miR-con組SLC39A7蛋白表達量(0.80±0.09)相比，過表達miR-139-5p組(0.36±0.04)顯著下降(P<0.05)；與anti-miR-con組SLC39A7表達量(0.81±0.10)相比，anti-miR-139-5p表達組(1.10±0.15)顯著上升(P<0.05)。見圖4B。說明miR-139-5p靶向負向調控SLC39A7的表達。

表3 敲減SLC39A7抑制腎癌細胞786-O細胞周期和增殖

圖3 Western印跡檢測SLC39A7、 CyclinD1、CyclinE蛋白表達

1～4:miR-con組，miR-139-5p組，anti-miR-con組，anti-miR-139-5p組圖4 miR-139-5p靶向調控SLC39A7表達

表4 雙熒光素酶活性檢測

2.5高表達SLC39A7可部分逆轉miR-139-5p對786-O細胞周期和增殖的影響 與miR-con組SLC39A7水平(0.82±0.13)相比，過表達miR-139-5p可抑制786-O細胞中SLC39A7表達(0.35±0.05，P<0.05)。與miR-139-5p+pcDNA-con組相比，miR-139-5p+pcDNA-SLC39A7組的SLC39A7、CyclinD1和CyclinE表達量顯著升高(P<0.05)，細胞存活率顯著升高(P<0.05)，G0/G1期和G2/M期細胞百分比顯著降低(P<0.05)，S期細胞百分比顯著升高(P<0.05)，見圖5和表5。說明過表達SLC39A7部分逆轉了上調miR-139-5p表達對786-O細胞周期和增殖的影響。

1～4:miR-con組，miR-139-5p組，miR-139-5p+pcDNA-con組，miR-139-5p+pcDNA-SLC39A7組圖5 Western印跡檢測SLC39A7、 CyclinD1和CyclinE蛋白

2.6Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的表達 與miR-con組786-O細胞中β-catenin表達水平(1.00±0.12)相比，過表達miR-139-5p組(0.45±0.05)顯著降低(P<0.05)；與miR-139-5p+pcDNA-con組786-O細胞中β-catenin表達水平(0.40±0.07)相比，miR-139-5p+pcDNA-SLC39A7組(0.86±0.09)顯著升高(P<0.05)，見圖6。說明過表達miR-139-5p可抑制Wnt/β-catenin信號通路，而過表達SLC39A7可激活Wnt/β-catenin信號通路并部分逆轉上調miR-139-5p表達對786-O細胞周期和增殖的影響。

表5 高表達SLC39A7可部分逆轉miR-139-5p對786-O細胞周期和增殖的影響

1～4：miR-con組，miR-139-5p組，miR-139-5p+pcDNA-con組，miR-139-5p+pcDNA-SLC39A7組圖6 Western印跡檢測β-catenin蛋白

3 討 論

RC是一種多基因突變的復雜疾病，盡管酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)是晚期RC的主要一線治療選擇，但最終所有患者都將對TKIs產生耐藥性〔8〕。發現新的抑制靶點，對RC的個性化靶向治療至關重要。miR-139-5p在多種癌癥包括乳腺癌、胃癌、子宮內膜漿膜腺癌、膀胱癌、卵巢癌、食管鱗狀細胞癌(ESCC)、甲狀腺癌、膠質母細胞瘤等中均出現差異表達，在腫瘤發生、轉移和復發中起著重要作用，提示它可能作為一種腫瘤診斷、預后和治療的生物標志物〔9〕。在口腔鱗狀細胞癌(OSCC)中，miR-139-5p表達下調〔10〕。miR-139-5p在肝癌細胞中也表達下調，抑制其表達可促進肝癌細胞的增殖〔11〕。miR-139-5p在轉移性RC中表達下調，與miR-10b、miR-130b、和miR-199b-5p一起可作為RC標志物〔12〕。本研究結果表明，miR-139-5p在RC發展中具有重要作用。SLC39A7又稱ZIP7，是鋅轉運蛋白溶質載體39家族第7成員，在細胞生物過程中控制鋅的轉運，SLC39A7定位在鋅介導的酪氨酸激酶信號傳導的關鍵節點上，從內質網釋放鋅，可能是酪氨酸激酶激活所必需的〔13〕，SLC39A7可能通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-AKT等途徑發揮作用，這些途徑參與細胞存活和增殖，并且在癌癥中經常被過度激活〔14〕。研究表明，SLC39家族中的14個基因包括SLC39A7在胃癌組織中均顯著上調，SLC39A7與患者總生存率顯著相關〔15〕。SLC39A7在結直腸癌中表達上調，主要是為了滿足癌細胞對鋅的需求〔16〕。SLC39A7在前列腺癌中也表達上調，下調其Wnt/β-Catenin信號通路抑制癌細胞的增殖和侵襲〔5〕。SLC39A7在RC中的表達尚不清楚。本研究結果說明SLC39A7在RC細胞的增殖中具有重要作用。Wnt/β-catenin信號通路是一種進化上保守的發育信號事件，在調節組織發育和維持體內平衡中起著關鍵作用，Wnt/β-catenin通路失調與癌癥、腎臟疾病、神經退行性疾病和骨疾病等多種疾病的發病機制密切相關〔17〕。在人RC中，不同Wnt、Wnt受體(Fzds)和Wnt拮抗劑和β-catenin出現異常表達，Wnt受體Fzd5和Fzd8的mRNA水平升高，導致下游靶基因CyclinD1增加，胞質β-catenin高水平與患者具有腫瘤直徑大、晚期和血管侵犯等特點相關〔18〕。綜上，本研究闡述了在RC 786-O細胞中，miR-139-5p靶向SLC39A7可能通過Wnt/β-catenin信號通路調控RC細胞周期和增殖。miR-139-5p可能是RC的潛在分子靶點。