自體脂肪間充質干細胞對帶狀皰疹大鼠JNK、PI3K、NGF表達及后遺疼痛的影響

張書力 馮丹 (武漢市第一醫院疼痛科，湖北 武漢 430022)

帶狀皰疹(HZ)是神經系統中水痘-帶狀皰疹病毒侵犯皮膚及神經所致，可引起受累神經根支配的皮膚區域皰疹，同時可伴有疼痛〔1〕。帶狀皰疹后神經痛(PHN)可引起患者視覺、聽覺等其他神經系統并發癥，并導致患者失明、耳聾、面癱、臟器功能異常，甚至死亡〔2,3〕。PHN屬于神經病理性疼痛(NP)，而背根神經節已成為NP的發病機制及其治療重點〔4〕。PHN好發于老年人，但目前臨床上的藥物治療、神經介入治療及神經調控治療等方法，治愈率效果不好，且患者疼痛長期難以控制〔5〕。近年，干細胞移植被用于多種NP的治療〔6〕，取自骨髓、脂肪等組織的脂肪間充質干細胞(ASCs)，具有高度增殖和自我更新能力〔7,8〕，能分泌生物活性因子，刺激患者體內殘留的特異性干細胞再生，進而發揮治療作用〔9〕。ASCs可為許多疾病提供新的治療方案，已成為臨床研究的熱點，但其對PHN的治療作用卻鮮見報道。神經生長因子(NGF)廣泛分布于神經系統和非神經系統中，能介導c-Jun氨基末端激酶(JNK)及磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)途徑調控神經和軸突生長、凋亡和再生，并能調節免疫系統功能，促進皮膚成纖維細胞修復〔10〕。目前研究發現NGF注射可用于治療PHN〔11〕，但具體分子生物學機制不甚明確。本研究結果探究ASCs對PHN大鼠疼痛及NGF、JNK、PI3K蛋白表達的影響。

1 材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1動物 清潔級同遺傳背景SD雌性大鼠50 只，體重 200～220 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號為SYXK(京)2012-0001。分籠飼養于南京中醫藥大學實驗動物中心，飼養條件：光照和黑暗各12 h交替進行，自由飲食、飲水，溫度22～25℃，相對濕度40%～70%，噪音低于80 dB，保持動物房環境及鼠籠清潔、透氣。

1.1.2主要試劑及儀器 CV-1非洲綠猴腎母纖維細胞(貨號：XB-1192，購自上海奧陸生物科技有限公司)、腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號：HT019，購自上海歌凡生物科技有限公司)、白細胞介素(IL)-1β ELISA試劑盒〔貨號：JK-(a)-4956，購自上海晶抗生物工程有限公司〕、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(貨號E677218-0200，購自上海生物公司)、mNGF抗體(貨號：ab32888)、PI3K抗體(貨號：ab139307)、蛋白激酶B(Akt)抗體(貨號：ab/18785)、磷酸化(p)-Akt抗體(貨號：ab38449)、T酪氨酸激酶受體(TrkA)抗體(貨號：ab216626)、TNF受體p75(p75NTR)抗體(貨號：ab25958)、JNK抗體(貨號：ab4821)、p-JNK抗體(貨號：ab47337)、蛋白提取試劑盒(批號：NXTRACT-1KT，購自西格瑪Sigma-Aldrich公司)、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(貨號：P0027，購自上海碧云天公司)。觸覺測痛儀(型號：Von Frey Filament，購自Stoeling公司)、手動輪轉式切片機(型號RM2125RTS，購自德國Leica公司)、光學顯微鏡(型號SMZ745，購自日本尼康公司)、蛋白電泳儀、半干轉膜儀(型號1659001、Trans-Blot SD，購自美國Bio-Rad公司)、凝膠成像儀(型號：GIS-500，購自Miulab公司)等。

1.2方法

1.2.1大鼠自體ASCs的分離、培養、鑒定、誘導 參照文獻〔12〕在無菌條件下，取SD大鼠腹股溝皮下脂肪組織少許，用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗凈殘留血液并去除血管|后，用0.1% Ⅰ型膠原酶在37℃條件下消化1 h，再加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養液終止消化后，將消化液經孔徑為100 μm和25 μm的尼龍膜過濾2次除去未消化的組織，離心收集細胞后。加入含10%FBS的DMEM培養液重懸細胞，置于37℃，5%CO2孵箱中培養24 h。72 h后移除懸浮細胞，待貼壁細胞生長融合至80%～90%時進行傳代和純化。取第3代ASCs加入異硫氰酸熒光素(FITC)-CD34抗體、FITC-CD45抗體、PE-CD29 抗體、FITC-CD90抗體和同型陰性對照鼠單克隆抗體振蕩混勻，4℃避光孵育30 min。PBS洗滌后離心棄上清，加入200 μl含0.1%多聚甲醛的PBS溶液混勻固定，經流式細胞儀檢測表型抗原。參照文獻〔13〕取第3代ASCs分別加入成骨細胞和成脂細胞誘導培養基進行培養，待細胞分化穩定后經油紅O染色觀察脂質空泡，經茜素紅染色鑒定鈣結節。細胞傳代培養14 d，每只大鼠可獲得約4×106個ASCs，用生理鹽水配制成1×106個/500 μl、2×106個/500 μl、4×106個/500 μl ASCs溶液。大鼠腹股溝縫合后1 w，傷口愈合，可用作后期試驗。

1.2.2大鼠PHN模型建立及分組給藥 參照文獻〔12〕復制水痘帶狀皰疹病毒(VZV)和構建大鼠PHN模型，具體操作如下：DMEM/F12完全培養基培養非洲綠猴腎母纖維細胞(CV-1)，并將懸浮細胞按照5×104個/cm2的細胞數接種于培養瓶，加入VZV感染CV-1細胞2 d(約有80%細胞發生感染)，收集上述細胞，加入生理鹽水重懸，即是病毒接種液。取1.2.1中50只SD大鼠，于左趾蹼注射50 μl病毒溶液，感染3 d后，大鼠出現機械痛敏閾值異常可判定制模成功。將造模成功的40只大鼠隨機分為模型(PHN)組、ASCs〔13〕低(1×106個)、中(2×106個)、高(4×106個)劑量組；另取10只1.2.1中大鼠，于左趾蹼注射生理鹽水作為空白對照(Control)組。造模成功后，參照文獻〔14〕進行鞘內插管給藥，插入管末端位于椎管L2節段，即脊髓L4～6節段，ASCs各組給予相應濃度的ASCs溶液500 μl，Control組和PHN組給予等劑量生理鹽水500 μl，給藥完成后輕輕取出插管，縫合肌肉和皮膚，蘇醒后回籠正常飼養。

1.2.3各組大鼠機械縮足痛敏閾值(PWT)檢測 各組大鼠行插管給藥2 w后，參照文獻〔15〕采用觸覺測痛儀測定各組大鼠PWT。大鼠單次刺激時間≤1 s，每次刺激間隔10 s，當大鼠出現抬足或舔足行為或躲避時記錄刺激強度，去掉最大及最小值，測定5次取平均值即為PWT。

1.2.4大鼠標本采集 測定完PWT后，3%戊巴比妥鈉麻醉處死各組大鼠，立即切開背部皮膚組織及腰背筋膜，沿棘突兩側剝離骸棘肌并向兩側推開，放入自動牽開器撐開兩側肌肉組織，露雙側L4、L5、L6椎板,咬除L4、L5、L6棘突、椎板,關節突和部分椎弓根，小心顯露雙側L4、L5、L6神經根及神經節，剪取0.5 g，勻漿后離心，取上清液于-20℃冰箱保存備用。迅速將剩余神經置于4%多聚甲醛中固定24 h。在鼠尾近段縱行切開皮膚、皮下組織至尾椎骨面，向兩側分離顯露2個椎間盤，橫向切開纖維環取出髓核組織，置于-80℃冰箱保存備用。

1.2.5各組大鼠背根神經節HE染色病理檢查 取1.2.4中4%多聚甲醛中固定24 h后的L4、L5、L6神經根及神經節，進行常規透明、浸蠟、包埋后、切成厚度為5 μm的切片。按HE試劑盒說明書進行染色，置于顯微鏡下觀察神經節神經細胞形態變化。

1.2.6各組大鼠髓核組織炎癥因子TNF-α、IL-1β含量測定 取1.2.4中-80℃冰箱中凍存的髓核組織，制備勻漿，離心分離后，取勻漿上清液，按ELISA試劑盒說明書方法，分別檢測組織TNF-α、IL-1β含量。

1.2.7Western印跡檢測神經節組織mNGF、PI3K、Akt、p-Akt、TrkA、p75NTR、JNK、p-JNK、Caspase-3蛋白表達 取1.2.4中-20℃保存的組織勻漿液，于4℃冰箱中解凍后，取上清液，用軸蛋白試劑盒提取蛋白，BCA試劑盒說明書檢測蛋白濃度后，取50 μg蛋白上樣，進行電泳和轉膜反應，TBST溶液清洗后，加入5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，TBST溶液清洗3次后，加入一抗〔mNGF、PI3K、Akt、p-Akt、TrkA、p75NTR、JNK、p-JNK、Caspase-3、β-actin(內參)抗體，稀釋倍數分別為1∶1 000，1∶1 000，1∶1 000，1∶1 000，1∶1 000，1∶1 000，1∶1 000，1∶1 000，1∶1 000，1∶2 000〕，4℃搖床室溫孵育過夜，TBST振洗后加入辣根過氧化物酶(HRP)羊抗兔二抗(稀釋倍數1∶2 000)，37℃搖床室溫孵育1 h，TBST清洗3次后，采用增強化學發光法顯色，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并以ImageJ軟件分析各組蛋白相對表達。

1.3統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行方差分析，進一步兩組間比較行SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1大鼠自體ASCs體外培養、鑒定結果 體外培養的第3代大鼠ASCs形態均一、貼壁、呈成長梭行。經流式細胞儀檢測，CD90和CD29表達均>95%,CD34和CD45表達呈陰性。體外成脂誘導液培養后，細胞能分化為成脂肪細胞，且紅油O染色顯示成脂質空泡陽性。體外成骨誘導液培養后，細胞能分化為成骨細胞，且茜素紅染色顯示有鈣結節。見圖1。

圖1 大鼠ASCs體外培養、鑒定結果

2.2大鼠背根神經節HE染色結果 Control組大鼠背根神經節內神經元細胞形態完整，核仁清晰，分布均勻。與Control組相比，PHN組大鼠背根神經節內神經元細胞形態和大小不一、邊界不清，可見細胞變形、溶解、壞死等病理損傷。與PHN組相比，ASCs低、中、高劑量組大鼠背根神經節病理損傷逐漸減輕，見圖2。

2.3各組大鼠PWT檢測結果 與Control組〔(42.56±4.25)s〕相比，PHN組PWT降低〔(16.86±2.93)s，P<0.05〕；與PHN組相比，ASCs低、中、高劑量組PWT依次明顯增高〔(22.35±2.76)s、(29.26±2.82)s、(35.22±2.65)s，均P<0.05〕。

圖2 各組背根神經節HE染色結果(×200)

2.4各組髓核組織炎癥因子TNF-α、IL-1β含量檢測結果 與Control組相比，PHN組、ASCs低、中、高劑量組髓核組織TNF-α、IL-1β含量升高(均P<0.05)；與PHN組相比，ASCs低、中、高劑量組大鼠髓核組織炎癥因子TNF-α、IL-1β含量依次明顯降低(均P<0.05)，見表1。

表1 各組髓核組織TNF-α、 IL-1β含量比較

2.5各組背根神經節組織mNGF、PI3K、Akt、p-Akt、TrkA、p75NTR、JNK、p-JNK、Caspase-3蛋白表達 與Control組，PHN組、ASCs低、中、高劑量組背根神經節組織mNGF、PI3K、p-Akt、TrkA p75NTR、p-JNK蛋白表達顯著降低，Caspase-3蛋白表達明顯升高(均P<0.05)；與PHN組相比，ASCs低、中、高劑量組mNGF、PI3K、p-Akt、TrkA p75NTR、p-JNK蛋白表達依次明顯升高，Caspase蛋白表達依次明顯降低(均P<0.05)。見圖3，表2。

1～5：Control組，PHN組，ASCs低劑量組，ASCs中劑量組，ASCs高劑量組圖3 Western印跡檢測各組mNGF、PI3K、Akt、p-Akt、 TrkA、p75NTR、JNK、p-JNK、Caspase-3蛋白表達

表2 大鼠背根神經節組織mNGF、PI3K、Akt、p-Akt、TrkA蛋白表達比較

3 討 論

PHN可持續數周、數月甚至數年，導致患者出現情感障礙、焦慮、抑郁等，嚴重影響患者的生活質量〔4〕。皮損區的異常疼痛及痛覺過敏為PHN的主要表現，接種皰疹病毒，可造成外周神經纖維壞死，神經支配區皮膚出現皰疹和炎癥反應，感覺神經節出現炎癥、出血性壞死及神經元壞死或缺失〔16〕。錢黎等〔17〕用皰疹病毒復制大鼠PHN模型，發現大鼠存在嚴重的痛覺過敏，PWT減少；馬洪濤等〔15〕通過接種VZV復制PHN模型，發現大鼠在接種后7 d痛覺達到高峰，并能持續14 d，脊髓炎癥因子TNF-α、IL-1β等釋放增加。本研究提示PHN模型大鼠出現痛覺過敏、炎癥反應和背根神經節神經細胞壞死，表明造模成功。

PHN屬于NP一種，當人體免疫力下降時，病毒在背根神經節內繁殖，引起感覺神經元受損，導致炎癥介質釋放，傷害感受器敏化，自發性疼痛增加，而隨著病情增加，神經纖維持續性異常放電，最終形成PHN。干細胞移植可被用于多種NP的治療，且自體ASCs移植具有安全性及有效性〔18〕。Elchim等〔19〕采用鞘內注射異體臍帶干細胞方法治療，可顯著降低脊髓外傷誘發NP男性患者疼痛程度，改善運動功能及自主神經功能；Vickers等〔20〕將ASCs注入10位難治性三叉神經痛女性患者病變的三叉神經周圍，發現半年內患者疼痛程度均顯著降低，鎮痛藥物需求量顯著減少；Franchi等〔21〕發現注射神經干細胞，可明顯減輕神經損傷模型大鼠誘發痛及熱痛覺過敏，且大鼠疼痛緩解程度與單次移植的干細胞數目呈正相關。本研究結果推測自體ASCs移植可能通過修復背根神經節神經元細胞損傷和壞死，降低髓核組織炎癥損傷，緩解PHN大鼠疼痛，但其修復機制不清楚。

NGF可由神經元、神經支配的靶組織或膠質細胞產生，具有促進中樞和外周神經分化、再生、調控神經系統發育和維持神經系統正常等功能〔10〕。近年研究發現，體外注射NGF可改善PHN癥狀，藍麗康等〔22〕發現肌內注射NGF可治療老年PHN，且疼痛緩解有效率和安全性較高。但NGF緩解PHN癥狀的分子機制，還不甚明確。研究發現NGF可與TrkA受體結合，通過PI3K/Akt途徑調控神經和軸突生長、凋亡和再生，且可與p75NTR受體結合，通過JNK途徑促進細胞凋亡〔11〕。Sang等〔23〕發現姜黃素對坐骨神經損傷患者神經元的保護作用，可能與上調NGF表達和激活PI3K/Akt通路有關；Blom等〔24〕發現JNK通路參與神經細胞增殖；鄭培兵等〔25〕發現NGF能通過上調JNK表達，促進神經元軸索的生長。本研究結果表明PHN模型大鼠中NGF表達減少，其介導的PI3K/Akt和JNK通路處于抑制狀態，可能與PHN大鼠神經元變性、損傷、凋亡有關。本研究結果推測自體ASCs移植修復PHN大鼠背根神經節神經元細胞損傷及緩解疼痛的作用，可能通過激活NGF介導的PI3K/Akt和JNK通路實現。

綜上，自體ASCs移植可能通過激活NGF介導的PI3K/Akt和JNK通路，修復背根神經節神經元細胞損傷和壞死，緩解PHN大鼠疼痛，初步為自體ASCs移植應用于臨床治療PHN提供了理論參考。但本研究還存在一定不足，自體ASCs移植改善PHN大鼠疼痛的機制和途徑相當復雜，本研究未設置通路抑制劑進行驗證，有待后續繼續研究。