玉米須多糖對高鹽誘導高血壓大鼠的抗血管氧化應激作用

梁衍鋒 尤清欣 谷青蕓 王景濤 舒濤 王鳳月 張嘉倪 宋紅瑞 王浩然 張東東

(佳木斯大學 1基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007；2臨床醫學院)

高血壓患病率呈逐年上升趨勢。中國每年由于血壓升高而導致過早死亡的人數高達200萬，每年直接醫療費用達366億元人民幣，是當今世界重大的公共衛生問題〔1〕。中國膳食構成以高鈉、低鉀為主，而人體鈉鹽的攝入量與高血壓患病率和機體血壓水平呈正相關〔2〕，這成為中國高血壓患者發病的重要危險因素。然而，高血壓發病機制的復雜性使其臨床治療效果卻不盡如人意。研究表明，機體中氧化應激是影響高血壓發生發展的重要機制〔3，4〕。有報道顯示，自發性高血壓大鼠(SHR)血漿活性氧簇(ROS)、丙二醛(MDA)等氧化應激指標明顯增高，而抗氧化物質超氧化物歧化酶(SOD)水平明顯降低〔5〕，說明降低高血壓患者體內氧化應激水平對高血壓的防治至關重要。玉米須是禾本科作物玉米的干燥花柱和柱頭，美國食品藥品管理局已確認其為無毒、安全的物質。玉米須提取物中含有多種化學成分，包括糖類、黃酮類、甾醇類、氨基酸、烷和無機元素等。玉米須多糖(PCS)是自玉米須中提取的水溶性提取物，含量達4%，具有明顯的抗氧化、降血糖、利尿、抑制腫瘤等作用〔6～8〕。本實驗通過給予高鹽誘導的高血壓大鼠強飼PCS進行干預，研究PCS抗氧化應激作用對其血壓的影響，并探討其降壓機制。

1 材料和方法

1.1儀器及試劑 BP-100 無創血壓測量系統、BL-420E生物機能實驗系統(四川成都泰盟)；細胞超聲波破碎儀(美國Thermo Scientific公司)；高速冷凍離心機(美國Eppendorf公司)；PowerPC電泳儀、Trans-Blot轉移電泳槽(美國Bio-Rad公司)；752 型紫外分光光度計(上海光學儀器廠)等。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)2、NOX4抗體(英國Abcam公司)；marker(美國Thermo Scientific公司)；活體組織氧化應激ROS初級熒光測定試劑盒(美國Genmed公司)；MDA、SOD測試盒(南京建成生物工程公司)；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國Millipore公司)。

1.2實驗設計 Dahl鹽敏感雄性大鼠40只，適應性喂養1 w，隨機分為正常飲食+生理鹽水(NS+vehicle)組、正常飲食+PCS(NS+PCS)組、高鹽飲食+生理鹽水(HS+vehicle)組、高鹽飲食+PCS(HS+PCS)組各10只。高鹽飲食中含8% NaCl，正常飲食中含0.3% NaCl，4 w后測量大鼠平均動脈壓(MAP)，MAP達到120 mmHg以上視為模型建立成功；HS+PCS組在模型制備成功后強飼PCS(400 mg/kg)20 d，其余組強飼等體積生理鹽水。

1.3PCS提取 采集佳木斯地區成熟期的玉米須制備成干燥品，剪碎后利用水溶醇沉法提取PCS。利用D101大孔樹脂對粗提物進行脫色，氯仿正丁醇(Sevage)法去除蛋白成分，再經無水乙醇、95%乙醇、丙酮、乙醚多次進行洗滌清除雜質，使用透析袋進行透析，干燥，用時采用生理鹽水現配現用。粗提率為3.21%。

1.4平均動脈壓(MAP)測量及主動脈采集 利用BP-100尾動脈血壓測量儀測量清醒狀態下的大鼠的MAP，MAP=(收縮壓+2×舒張壓)/3。將清醒大鼠放入固定器，依次將阻斷器與傳感器套于大鼠的尾部，待大鼠平靜后測量血壓，取8次測量平均值。所有藥物干預結束后，采用BL-420E生物機能實驗系統經頸動脈插管測量大鼠MAP，結束后迅速采集胸主動脈，一部分馬上進行ROS水平檢測，另一部分-80℃冰箱保存備用。

1.5蛋白提取及定量 低溫狀態下取胸主動脈研碎，洗滌，離心棄上清。加入冷存的50×蛋白酶抑制劑20 μl及蛋白裂解液1 ml，冰浴條件下放入細胞超聲破碎儀破碎，4℃下離心，13 000 r/min，15 min。取上清，使用二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白質定量檢測，-80℃冰箱保存備用。

1.6Western印跡檢測 按照凝膠配制試劑盒使用說明制備凝膠，將配好的凝膠按要求注入膠板空隙內，插梳，備用。取出低溫保存的marker、樣品，使用微量上樣器將marker、樣品依次加入對應的泳道。低溫狀態下電泳使蛋白分離。切膠，將厚濾紙、凝膠、PVDF膜、厚濾紙依次疊在一起，蓋好蓋板。接通電源，低電壓條件下轉膜。室溫封閉后，加入稀釋的一抗(NOX2、NOX4)，冰箱孵育過夜。取出過夜膜室溫下復溫，TBST洗滌，10 min/次，3次。加入相應二抗，室溫下置于搖床孵育 1 h。 TBST 洗滌，10 min/次，3次。將洗滌好的膜置于化學發光成像儀內，加電化學發光(ECL)液成像，拍照采集。對采集的圖像使用Quantity One軟件進行分析。

1.7主動脈ROS水平測定 取新鮮胸主動脈，按照活體組織氧化應激ROS初級熒光測定試劑盒說明操作，低溫下清理液清理后無菌濾紙吸干切碎，稀釋液充分混合勻漿，與染色工作液放入石英比色杯，激發波長490 nm，散發波長520 nm，熒光分光光度儀檢測。

1.8血漿MDA水平及SOD活力檢測 實驗結束后各組大鼠禁食12 h，采用腹腔注射10%水合氯醛麻醉，頸動脈插管測量血壓后取血，2 000 r/min離心分離血漿。按照試劑盒的說明分別采用硫代巴比妥酸(TBA)法和水溶性四唑藍(WST)-1法檢測血漿MDA水平和SOD活力。

1.9統計學處理 采用SPSS17.0 軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1各組不同給藥時間MAP變化比較 與NS+vehicle組相比，NS+PCS組無明顯差異(P>0.05)，HS+vehicle組和HS+PCS組MAP明顯增高(P<0.05)；與HS+vehicle組相比，HS+PCS組MAP從給藥第9天開始MAP明顯降低，到第20天時MAP最低(P<0.05)，見表1。

表1 各組不同給藥時間MAP比較

2.2各組主動脈NOX2、NOX4表達、ROS、MDA水平及SOD活力比較 與NS+vehicle組相比，NS+PCS組各指標無明顯差異(P>0.05)；HS+vehicle組和HS+PCS組主動脈NOX2、NOX4蛋白表達、ROS及MDA水平明顯增高，而SOD活力明顯降低(均P<0.05)；與HS+vehicle組相比，HS+PCS組主動脈NOX2、NOX4蛋白表達、ROS及MDA水平明顯降低，而SOD活力明顯增高(均P<0.05)，見圖1、表2。

圖1 各組主動脈NOX2、NOX4表達

表2 各組主動脈NOX2、NOX4、ROS及血漿MDA、SOD水平比較

3 討 論

高血壓作為多基因遺傳病，其發生發展受到環境和生活習慣等多種因素的影響。鈉鹽的過度攝入與高血壓發病密切相關。本研究結果進一步證明了高鹽飲食是促進高血壓發生的重要因素。目前對于PCS研究主要集中于其抗氧化、抗感染、降血糖和抑制腫瘤等作用〔6～8〕，其對于高血壓的影響及機制的研究尚需要更多的理論依據。本研究結果說明PCS對高鹽誘導的高血壓具有明顯的降壓效果，但其對于正常血壓者并未發生明顯影響，可見其治療高血壓具有安全性。這與一項研究中提出的PCS能明顯降低血壓的結果相一致〔9〕。

氧化應激是氧自由基產生和消除失衡導致體內ROS過量蓄積的過程，其與多種疾病的發生發展密切相關。ROS在血管內主要由NOX催化產生。人類NOX基因組包括NOX1、NOX2(即gp91phox)、NOX3、NOX4、NOX5、Duox1和Duox2共7個成員。其中NOX2和NOX4作為NADPH氧化酶的2個重要亞型，其在血管內ROS的形成中至關重要〔10〕。SOD是體內重要的抗氧化酶，可通過催化超氧陰離子發生歧化反應而減少氧自由基對機體的損傷〔11〕。本研究結果說明主動脈中NADPH氧化酶介導的ROS增加可能是促進高血壓發生發展的重要機制。體內蓄積的氧自由基能攻擊生物膜的多不飽和脂肪酸，從而引發脂質過氧化，并形成脂質過氧化物，如MDA。而SOD作為抗氧化酶是機體清除自由基的首要物質，因此SOD活力測定常與MDA水平測定相互配合進行，來反映機體清除氧自由基的能力和受自由基攻擊的嚴重程度〔12〕。本研究結果說明高血壓時機體抗氧化能力下降，血管中自由基引起的脂質過氧化與高血壓密切相關。上述實驗結果均說明血管氧化應激反應是高鹽誘導的高血壓的重要發病機制。

PCS具有明顯的抗氧化作用。研究表明，水提醇沉法制備的PCS清除超氧陰離子和羥基自由效果顯著〔7〕。本研究結果說明PCS可明顯有效抑制高血壓時血管ROS合成酶NOX2 和NOX4的表達，降低血管ROS水平，抑制脂質過氧化反應，同時增強血管抗氧化能力，從而改善高鹽誘導的高血壓。研究報道，高血壓時ROS水平失衡能促進外周血管收縮，從而引起血壓進一步升高〔13～15〕。結合PCS在本研究中對于高鹽誘導的高血壓的降壓作用，提示PCS可能通過降低血管氧化應激反應、增強抗氧化能力，并進而影響血管舒縮功能，達到降低高鹽誘導的高血壓的作用。